[發(fā)明專利]一種雞滑液囊支原體培養(yǎng)基及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011237175.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN112410248B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱杰;翟慶賀;楊靈芝;耿興良;吳洪才;李香云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 張貴賓

本發(fā)明涉及一種雞滑液囊支原體培養(yǎng)基及其制備方法，培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助成分，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、水解乳蛋白、輔酶Ⅰ、精氨酸鹽酸鹽、L?半胱氨酸鹽酸鹽、MEM、酵母浸粉、1％酚紅和海藻糖；輔助成分包括豬血清和青霉素。本發(fā)明的培養(yǎng)基顯著提高了雞滑液囊支原體菌液的抗原含量，其菌液滴度高達(dá)10^12.0?13.0CCU/ml，同時(shí)顯著提升了MS野毒株的分離率，高達(dá)93％，培養(yǎng)基的制備的方法提高了雞滑液囊支原體的抗原含量，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞滑液囊支原體培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)

雞滑液囊支原體病，又稱雞傳染性滑膜炎，是由雞滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)引起雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿等的一種以關(guān)節(jié)滲出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎為特征的急性或慢性傳染性疾病，一般不容易觀察到，主要表現(xiàn)為亞臨床癥狀。MS與新城疫病毒、雞傳染性支氣管病毒、大腸桿菌等混合感染時(shí)會(huì)加重病情。MS屬于柔膜細(xì)菌目，滑液囊支原體不同于其他支原體，1956年它首先被Olson等提出來，并被定為一個(gè)獨(dú)立的種。雞感染后可導(dǎo)致明顯的跛行，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及胴體降級(jí)等。與雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)一樣，雞滑液囊支原體感染已遍及全球。該病在雞群中普遍存在，主要侵害商品肉雞、蛋雞或種雞，一旦引入很難清除，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

MS由于其基因組較小，基因組中缺少很多必須的編碼氨基酸和輔助因子生物合成的基因，從而導(dǎo)致能量代謝緩慢，屬于氨基酸、脂類和某些輔助因子營(yíng)養(yǎng)缺陷型，需要從外界獲取多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)代謝繁殖，造成其培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜，培養(yǎng)條件苛刻。目前，臨床上已經(jīng)有分離MS和生產(chǎn)MS疫苗使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基一般由Frey或PPLO培養(yǎng)基改良而來。但是已有的傳統(tǒng)給培養(yǎng)基MS活菌滴度低(在1.0×10^8-10CCU/ml)，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)24～48h，抗原蛋白濃度低(30-50ug/ml)，制苗用菌液(半成品)生產(chǎn)滅活苗時(shí)需要濃縮，而半成品的濃縮操作繁重、復(fù)雜，易污染，濃縮過程損失較大，最終影響成品疫苗的保護(hù)效力，并且進(jìn)一步提高了疫苗的生產(chǎn)成本，已有的傳統(tǒng)培養(yǎng)基其制苗添加的血清普遍在10-30％之間，過量的血清制備的疫苗無疑給雞只增加異源體對(duì)雞的過敏應(yīng)激反應(yīng)，最終影響疫苗的免疫效力，且增加生產(chǎn)成本。已有的傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行MS分離時(shí)，病原檢出率低且生長(zhǎng)緩慢(初次分離所需時(shí)間平均為7-12d)，不利于診斷及臨床藥物篩選。

因此，本領(lǐng)域需要一種低成本、高效，適用于雞滑液囊支原體大批量生產(chǎn)制備的培養(yǎng)基，進(jìn)而開展MS感染的分離與免疫防控研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種雞滑液囊支原體培養(yǎng)基及其制備方法，既簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)培養(yǎng)基的復(fù)雜工藝，又減少了血清等成分的使用，降低了外源異物對(duì)雞只的過敏反應(yīng)，降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本。同時(shí)，使用本發(fā)明培養(yǎng)基可以使雞滑液囊支原體的活菌滴度高到1×10^12.0-13.0CCU/ml以上，活菌滴度和分離的敏感性遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基，更適合雞滑液囊支原體的分離鑒定和疫苗生產(chǎn)。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

提供一種雞滑液囊支原體培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助成分，其特征在于：基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、水解乳蛋白、輔酶Ⅰ、精氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、MEM、酵母浸粉、1％酚紅和海藻糖；輔助成分包括豬血清和青霉素。

進(jìn)一步的，上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各組分的重量為：磷酸鹽緩沖液800～1000ml、葡萄糖5-18g、水解乳蛋白3～9g、輔酶Ⅰ0.5～1.5g、精氨酸鹽酸鹽5～15ml、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5～1.5g、MEM2～5g、酵母浸粉1-5g、1％酚紅、海藻糖1-5g；上述輔助成分中各組分的濃度為：豬血清5-10％和80萬單位/ml青霉素1-2ml/L。

進(jìn)一步的，磷酸鹽緩沖液包括氯化鈉5.0g、氯化鉀0.4g、七水硫酸鎂0.2g、十二水合磷酸氫二鈉1.6g和磷酸二氫鉀0.2g。