[發明專利]抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段側翼序列及其應用

有效

• 申請號: 202011233974.6
• 申請日: 2020-11-07
• 公開（公告）號: CN112359038B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 唐桂香;鐘宣伯;劉璐璐;崔楠;李建飛;舒躍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/6895
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1?2外源插入片段側翼序列及其應用。本發明公開了一種抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1?2外源插入片段側翼，左邊界側翼的500bp如SEQ ID NO:1所述；右邊界側翼的500bp如SEQ ID NO:2所述。提取轉基因大豆事件ZHs1?2基因組DNA，利用基因組重測序技術分析確定外源片段插入位點，并通過PCR擴增獲得。其用途是檢測待測樣品是否含有來源于ZHs1?2的成分。

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段側翼序列及其應用。

背景技術

轉基因植株特異性轉化事件的檢測，依賴于外源基因插入位點旁側序列分析，根據已知的旁側序列，設計相應的引物進行。因此，明確T-DNA插入位點的信息對相關研究的順利開展非常重要。在轉基因生產應用中，外源基因的插入位點是每份基因轉化事件的標簽，轉化事件的篩選鑒定、轉化事件的安全性評價、環境釋放申請等都要求提供每份基因轉化事件的T-DNA插入位點和插入基因的旁側序列。

目前獲取T-DNA插入位點旁側序列的方法有很多，根據原理可以分為3類：反向PCR，外源接頭介導PCR，半隨機引物PCR(如Tail-PCR)。另外，其他方法如質粒拯救法(plasmid rescue)、PCR-walking法等，都已經被廣泛用于插入位點的鑒定及側翼序列的獲取。但是，這些方法除了操作步驟復雜、消耗時間長等缺點外，還具有很大的不確定性，特異性比較差，無法獲得很高的成功率。

近年來，隨著測序技術的不斷發展，全基因組重測序技術漸趨成熟。全基因組重測序的時間與成本大幅度下降，使得全基因組重測序的應用越來越廣泛，除了用于測定不同物種全基因組序列、構建全基因組圖譜外，還被用于突變體基因克隆和插入位點旁側序列分析等方面。

轉基因大豆事件ZHs1-2是利用農桿菌介導法將外源Hs1^pro-1基因導入栽培大豆品種天隆一號中獲得的。ZHs1-2轉化載體為pHs1，結構圖譜如圖1所示。該載體含有為Hs1^pro-1基因277bp～1122bp之間一個開放閱讀框架，共846bp，另外含有編碼膦絲菌素乙酰轉移酶基因即BAR基因，作為篩選標記基因，表現為對除草劑草丁膦的抗性，所用的農桿菌菌株為EHA105。所述轉化載體pHs1和轉基因大豆事件ZHs1-2均由浙江大學作物科學研究所2013年碩士生李紅艷完成，關于載體構建和轉化事件的獲得詳見李紅艷撰寫的碩士論文《抗胞囊線蟲轉基因大豆種質創新研究》(2013)中。

發明內容

本發明要解決的問題是提供一種抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段側翼序列及其應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段側翼，左邊界側翼的500bp如SEQ ID NO:1所述；右邊界側翼的500bp如SEQ ID NO:2所述。

作為本發明的抗胞囊線蟲轉基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段側翼的改進：由來源于大豆基因組序列和來源于外源插入片段序列組成的DNA序列，如SEQ ID NO:5所述；

所述SEQ ID NO:5第1-500位點序列來源于栽培大豆天隆一號基因組序列(SEQ IDNO:1)，第501-5476位點序列來源于外源T-DNA插入片段序列，第5477-5976位點序列來源于栽培大豆天隆一號基因組序列(SEQ ID NO:2)；

因此，SEQ ID NO:5為外源插入片段及插入片段左側和右側側翼序列，共5976bp；SEQ ID NO:1是外源T-DNA插入到大豆基因組中左側的大豆基因組側翼序列，第501-5476位點序列為外源插入到大豆基因組中的T-DNA序列；SEQ ID NO:2為T-DNA插入位點右側的大豆側翼序列，即第5477-5976位點序列。