[發(fā)明專利]一種合成無修飾RNA文庫及用來校準RNA修飾檢測的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011230780.0
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112375806B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 駱觀正;張璋
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 深圳市創(chuàng)富知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44367
• 代理人: 李思坪

1.一種無修飾RNA文庫的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、以RNA作為起始，以polyT引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，使用具有模板置換能力的反轉(zhuǎn)錄酶和T7啟動子序列引物通過反轉(zhuǎn)錄在第一鏈cDNA合成時在RNA的5‘端加上T7啟動子序列，所述的RNA包括Total RNA，磁珠純化得到的mRNA，采用rRNA去除方法得到的mRNA，所述的具有模板置換能力的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶；具體操作方法為：先制備mRNA+ployTprimer：mRNA 100ng，PolyT primer 12μM 1uL，共4uL，然后70℃反應(yīng)3分鐘，42℃反應(yīng)2分鐘；再合成第一鏈cDNA：mRNA+ployT primer 4uL，5×First-Strand bufferofSMARTScribe Reverse Transcriptase 2uL，100mM DTT 0.5uL，RNase inhibitor0.5uL，TSO T7 Primer10μM 1uL，50×Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix1uL，SMARTScribe Reverse Transcriptase 1uL，共10uL，然后42℃反應(yīng)1.5小時，68℃反應(yīng)10分鐘；所述ployT primer的序列如SEQ ID NO.1所示，所述TSO T7 Primer的序列如SEQID NO.2所示；

S2、在步驟S1的第一鏈cDNA的基礎(chǔ)上采用引物延伸法以T7延伸引物合成雙鏈cDNA，使雙鏈cDNA在5‘端具有T7啟動子序列；具體操作方法為：步驟S1的產(chǎn)物10uL，50×AdvantageUltraPure PCR Deoxynucleotide Mix 2uL，RNaseH 2uL，10×Advantage 2PCR buffer10uL，Advantage 2PCR Polymerase mix 1uL，T7 Extension Primer 2uL，RNase-freewater補正至100uL，然后37℃反應(yīng)15分鐘，95℃反應(yīng)2分鐘，60℃反應(yīng)1分鐘，68℃反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)后得到雙鏈cDNA；所述T7 Extension Primer的序列如SEQ ID NO.4所示；

S3、采用體外轉(zhuǎn)錄的方法從雙鏈cDNA中轉(zhuǎn)錄出與體內(nèi)提取的RNA具有相同序列的體外轉(zhuǎn)錄RNA，得到無修飾RNA文庫。

2.采用權(quán)利要求1所述的合成方法合成得到的無修飾RNA文庫在RNA修飾檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所述RNA修飾檢測為非疾病診斷和治療目的的檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述RNA修飾的檢測方法包括MeRIP-seq檢測方法、m6A-REF-seq檢測方法、m5C BS-seq檢測方法，所述RNA修飾的檢測為非疾病診斷和治療目的的檢測。

4.一種降低RNA修飾檢測假陽性的方法，其特征在于，在RNA修飾檢測中，以采用權(quán)利要求1所述的方法合成的無修飾RNA文庫作為負對照，所述RNA修飾的檢測為非疾病診斷和治療目的的檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種降低RNA修飾檢測假陽性的方法，其特征在于，首先用提取的RNA采用權(quán)利要求1所述的方法合成無修飾RNA文庫，然后采用RNA修飾檢測方法同時對體內(nèi)提取的RNA和無修飾RNA文庫進行處理，并通過高通量測序檢測出修飾信號，用體內(nèi)提取的RNA的修飾信號排除掉無修飾RNA文庫得到的假陽性修飾信號，即可得到RNA修飾的真陽性信號，所述RNA修飾的檢測為非疾病診斷和治療目的的檢測。