[發(fā)明專利]一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011230529.4
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112322631B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 凌飛;劉寶紅
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢天問生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54;C12Q1/6895
• 代理公司: 湖北天領(lǐng)艾匹律師事務(wù)所 42252
• 代理人: 楊建軍

本發(fā)明提出一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，涉及利用基因工程培養(yǎng)植物領(lǐng)域。所述培育方法中，構(gòu)建包含目標基因I.variabilis?EPSPS*基因的載體pTWGM1，將含有表達載體pTWGM1的農(nóng)桿菌菌株與大豆子葉節(jié)外植體進行侵染與共培養(yǎng)后，經(jīng)草甘膦的篩選誘導(dǎo)叢生芽，再誘導(dǎo)芽伸長至3cm左右時，生根培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因T0代幼苗。在T0代植株生長期間，通過篩選陽性植株，并通過Southern blot鑒定陽性植株的拷貝數(shù)，對單拷貝植株進行收種。在T1代，轉(zhuǎn)基因植株分家系進行種植，通過田間觀察，噴施草甘膦，挑選草甘膦耐受性好且農(nóng)藝性狀無明顯改變的轉(zhuǎn)基因家系。通過本方法獲得的轉(zhuǎn)基因大豆外源基因在其后代可以穩(wěn)定遺傳且具有草甘膦除草劑耐受性，可減少生產(chǎn)管理中的勞動力成本，提高種植效益。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法。

【背景技術(shù)】

大豆(Glycine max(L.).Merr)起源于中國，是世界上重要的油料作物和經(jīng)濟作物，也是食用植物油與植物蛋白質(zhì)的主要來源。雜草作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，可以與作物競爭光、水、養(yǎng)分等資源，從而使作物減產(chǎn)。因此，大豆田間雜草的有效防除是大豆穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。傳統(tǒng)的人工除草包括手工拔草和使用簡單農(nóng)具除草等，耗時耗力，功效低且不能大面積及時防除。化學(xué)除草劑的使用大大提高了農(nóng)田雜草的防治效率，但是傳統(tǒng)除草劑如氯嘧磺隆、甲磺隆等在土壤中殘留嚴重、污染環(huán)境，限制了這些除草劑的使用范圍。

草甘膦(Glyphosate)為內(nèi)吸傳導(dǎo)型、廣譜滅生性除草劑，具有殺草譜廣、高效、低毒、無殘留等優(yōu)點，尤其對人畜毒害小，是全球應(yīng)用范圍最廣的除草劑之一。但作為一種非選擇性除草劑，草甘膦在殺滅雜草的同時也傷害大豆，因此通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物，賦予作物抗草甘膦特性，是保護作物不受草甘膦傷害，提高雜草綜合防治效率的重要途徑之一。已有的研究和轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展歷史證明大豆對草甘膦除草劑的耐受性將是對于雜草防除、管理的有用性狀。

為賦予農(nóng)作物草甘膦的耐受性，研究者集中于向植物體內(nèi)導(dǎo)入能增加草甘膦耐受性的基因，如EPSPS，EPSPS基因通常來自于微生物，其編碼酶的結(jié)構(gòu)特性使得草甘膦不能與其結(jié)合，因而在草甘膦存在的情況下仍然能夠保持了他們的催化活性(PCT/CN03/00651)。當(dāng)前全球商業(yè)化種植的草甘膦抗性轉(zhuǎn)基因作物絕大多數(shù)為針對EPSPS所設(shè)計。

在植物組織中N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)能夠通過N-乙酰化作用使得草甘膦被有效的降解，從而失去除草劑活性，且乙酰化的草甘膦不能與植物體內(nèi)的EPSPS有效的結(jié)合，從而賦予植物對草甘膦的耐受性(ZL 200510086626.X)。此外，由于草甘膦的降解，利用N-乙酰化的手段培育轉(zhuǎn)基因作物可以在植物整個生長周期都可以施用草甘膦，不受生長發(fā)育階段的限制。

當(dāng)前，關(guān)于抗草甘膦基因?qū)氪蠖沟难芯勘容^廣泛，但不同位點的插入會影響大豆其他基因的功能，因此有必要結(jié)合抗草甘膦基因的合成，實現(xiàn)不同位點的插入，滿足外源基因在其后代可以穩(wěn)定遺傳且具有草甘膦除草劑耐受性，以減少生產(chǎn)管理中的勞動力成本，提高種植效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

基于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的培養(yǎng)方法，通過外源基因載體的優(yōu)化，并插入到不同位點，獲得滿足外源基因在其后代可以穩(wěn)定遺傳且具有草甘膦除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆。

鑒于此，本發(fā)明的目的在于，提出一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，將外源基因DNA片段插入天隆1號大豆基因組第19號染色體內(nèi)得到轉(zhuǎn)基因大豆，插入位點的左邊界側(cè)翼序列如SEQ ID NO：1所示，插入位點的右邊界側(cè)翼序列如SEQ ID NO：2所示；所述外源基因DNA片段包含草甘膦抗性基因。

進一步地，所述外源基因DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

進一步地，所述外源基因DNA片段用抗草甘膦基因I.variabilis-mEPSPS構(gòu)建植物表達載體所得。