[發(fā)明專利]基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011225724.8
• 申請(qǐng)日: 2020-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN112301100A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白云峰;趙璐;趙瑞瑞;馮海弟;陳曉亮;張慧琳;馮鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西大同大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6825
• 分類號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/682;G01N33/574
• 代理公司: 太原申立德知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.一種基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器，其特征在于，包括核酸適配體探針與發(fā)夾探針，所述核酸適配體探針包括核酸適配體序列、引發(fā)鏈序列及互補(bǔ)序列，所述發(fā)夾探針包括第一發(fā)夾探針與第二發(fā)夾探針，所述第一發(fā)夾探針和所述第二發(fā)夾探針包括G-四鏈體核酶堿基的序列，所述核酸適配體探針特異性識(shí)別前列腺特異性抗原，所述核酸適配體探針構(gòu)象轉(zhuǎn)換，使所述第一發(fā)夾探針與所述第二發(fā)夾探針形成雙鏈DNA，同時(shí)，在hemin存在的情況下，所述第一發(fā)夾探針與所述第二發(fā)夾探針自組裝形成hemin/G-四鏈體核酶，所述hemin/G-四鏈體核酶催化氧化過(guò)氧化氫介導(dǎo)的硫胺素并發(fā)出熒光，可定量檢測(cè)所述前列腺特異性抗原。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器，其特征在于，所述核酸適配體探針為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器，其特征在于，所述核酸適配體序列為特異性識(shí)別前列腺特異性抗原的核酸適配體序列，所述核酸適配體序列為5’-ATTAAAGCTCGCCATCAAATAGC-3’。

4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于檢測(cè)前列腺特異性抗原。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述前列腺特異性抗原檢測(cè)的具體過(guò)程包括以下步驟：

(1)核酸適配體探針、第一發(fā)夾探針與第二發(fā)夾探針首次開蓋使用前先離心，分別將其溶于二次水中配成濃度都為100μM的母液，再用第一緩沖液分別稀釋成核酸適配體探針溶液、第一發(fā)夾探針溶液和第二發(fā)夾探針溶液，在4℃保存待用；

(2)將步驟(1)得到的核酸適配體探針溶液、第一發(fā)夾探針溶液與第二發(fā)夾探針溶液分別加熱反應(yīng)并冷卻至室溫備用；

(3)將步驟(2)加熱反應(yīng)后的核酸適配體探針溶液、第一發(fā)夾探針溶液、第二發(fā)夾探針溶液用第一緩沖液稀釋成一定濃度與不同濃度的前列腺特異性抗原溶液、免疫球蛋白G、甲胎蛋白或者癌胚抗原在第一緩沖液中反應(yīng)，得到混合液；

(4)在步驟(3)的混合液中加入hemin反應(yīng)，得到反應(yīng)液；

(5)將步驟(4)的反應(yīng)液與硫胺素、過(guò)氧化氫在第二緩沖液中反應(yīng)，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中核酸適配體探針溶液、第一發(fā)夾探針溶液和第二發(fā)夾探針溶液的濃度分別為5μM、5μM、5μM。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述第一緩沖液為Tris-HCl緩沖液，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.4，所述第二緩沖液為K₂HPO₄-NaOH緩沖液，所述K₂HPO₄-NaOH緩沖液的pH為12，所述步驟(2)中加熱反應(yīng)溫度為85℃～95℃，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘～15分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)中核酸適配體探針溶液濃度為10nM～100nM，第一發(fā)夾探針溶液濃度為10nM～100nM，第二發(fā)夾探針溶液濃度為10nM～100nM，反應(yīng)溫度為25℃～45℃，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)～8小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(4)中hemin的濃度為0.1μM～1μM，室溫下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)～4小時(shí)。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酶的熒光適配體傳感器的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(5)中硫胺素溶液濃度為5mM，過(guò)氧化氫溶液濃度為25mM，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘～30分鐘。