[發(fā)明專利]一種腫瘤組織消化液及其方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011221294.2
• 申請日: 2020-11-05
• 公開（公告）號: CN112322586A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林傳勇;吳聲鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州元信生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 深圳科灣知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44585
• 代理人: 鐘斌

本發(fā)明公開了一種腫瘤組織消化液及其方法，消化液包括有以下成份：II型膠原酶2mg/ml；IV型膠原酶2mg/ml；Dispase(中性蛋白酶)0.2ml/ml；DNA酶12units/ml；FBS體積分數(shù)10％；DMEM 0.8ml/ml；CaCl₂ 3mM。本發(fā)明所提供的腫瘤組織消化液增加了Dispase(中性蛋白酶)，該蛋白酶可以更好地對致密的腫瘤細胞之間蛋白連接進行消化解離，同時提高了Dispase酶含量，顯著地提高了消化效率。此外，本發(fā)明所提供的腫瘤組織消化液新增了IV型膠原酶，可以顯著地提高消化效率，減少消化時間，而且本發(fā)明的消化液中膠原酶IV和II的濃度較低，可以降低細胞損傷，提高細胞懸液中細胞活率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤組織消化液及其方法。

背景技術(shù)

隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，為了解決基因高通量測序技術(shù)在腫瘤學研究過程中掩蓋了細胞之間的異質(zhì)性的問題，由于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能在單細胞水平上揭示腫瘤組織中不同細胞的特性和相互聯(lián)系，為了研究單個腫瘤細胞的生物學特性，腫瘤細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)在腫瘤學方面成為臨床專家和科研工作人員關(guān)注的焦點。

單細胞懸浮液在腫瘤病理、腫瘤分子生物學研究方向有著廣泛的用途，目前常用的新鮮腫瘤的組織單細胞懸液的制備方法主要為：先利用機械和酶處理進行組織解離，之后利用酶促消化用于分離。不同腫瘤組織消化目前使用的酶方案可能不同，對于較敏感的細胞類型在不同的細胞消化過程中可能會被破壞，部分腫瘤組織手術(shù)后組織含量不高，導致消化后細胞懸液消化不足，影響后續(xù)實驗進行。

目前在腫瘤消化過程中，存在的問題主要有：組織消化不徹底、消化時間長、酶濃度過高等導致細胞死亡，導致后續(xù)的實驗出現(xiàn)一系列問題。

目前腫瘤細胞分離方法將為常見的是通過II型膠原酶消化法來進行獲取，但是該方法存在較多的缺點，主要包括：1、II型膠原酶雖然屬于溫和的消化酶，但是依然對細胞有損傷，特別是在消化過度時，對細胞的損傷十分明顯。2、II型膠原酶在使用過程中極易出現(xiàn)活性喪失，降低消化作用，嚴重的將導致無法實現(xiàn)對腫瘤細胞的消化分離。3、使用II型膠原酶消化后腫瘤細胞容易消化不完全，消化時間過長，這將會導致后續(xù)單細胞測序的實驗進行較為嚴重的影響。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種腫瘤組織消化液及其方法，在腫瘤組織消化中細胞獲取率高且細胞具有較高的活性，細胞得率高，對細胞損傷較小，轉(zhuǎn)錄組變化低，可以后續(xù)進行培養(yǎng)或者單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種腫瘤組織消化液，包括有以下成份：

II型膠原酶 2mg/ml；

IV型膠原酶 2mg/ml；

Dispase 0.2ml/ml；

DNA酶 12units/ml；

FBS 體積分數(shù)10％；

DMEM 0.8ml/ml；

CaCl₂ 3mmol/L。

本發(fā)明還提供一種利用上述腫瘤組織消化液制備腫瘤組織單細胞懸浮液的方法，包括如下步驟：

S1：獲得腫瘤組織；

S2：將腫瘤組織置于平皿中，用移液器向腫瘤組織滴加2-3滴權(quán)利要求1所述腫瘤組織消化液防止干燥；

S3：將腫瘤組織切碎，添加權(quán)利要求1所述腫瘤組織消化液進行消化；置于37℃搖床30-40min，每隔15min用移液器混勻；