[發明專利]一種構建DNA片段敲除文庫的方法在審
| 申請號： | 202011219314.2 | 申請日： | 2020-11-04 |
| 公開（公告）號： | CN113462681A | 公開（公告）日： | 2021-10-01 |
| 發明（設計）人： | 蔣棟;王江華;謝興旺;王雪艷;畢晶磊;史云強 | 申請（專利權）人： | 北京可瑞生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12N15/867;C12N15/65;C40B50/06;C40B40/02 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人： | 商秀玲 |
| 地址： | 102200 北京市昌平區*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 構建 dna 片段 文庫 方法 | ||
1.一種敲除DNA片段的方法，其特征在于，對擬敲除DNA片段上下游設置2個以上的sgRNA，使用Cpf1酶進行敲除，sgRNA設置標準為：擬敲除DNA片段同側兩個sgRNA切割位點間隔為30-100bp。
2.一種敲除DNA片段的方法，其特征在于，對擬敲除DNA片段上下游設置2個以上的sgRNA，使用Cpf1酶進行敲除，sgRNA設置標準為：擬敲除DNA片段兩側sgRNA切割位點最大間隔距離為10Kb。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)使用第一載體構建Cpf1酶穩定轉導的細胞系；
(2)根據所述sgRNA設置標準，設置一組sgRNA序列，組中包含識別片段上游切割位點的sgRNA序列及識別片段下游切割位點的sgRNA序列，形成sgRNA陣列；
(3)將sgRNA陣列裝載到慢病毒載體上，得到第二載體，包裝制備慢病毒，轉導步驟(1)構建得到的細胞系。
4.一種利用Cpf1酶構建基因敲除文庫的方法，其特征在于，所述文庫包含能夠敲除多個DNA片段的質粒pool，步驟如下：
(1)使用第一載體構建Cpf1酶穩定轉導的細胞系；
(2)根據權利要求1或2所述sgRNA設置標準，為每個擬敲除的DNA片段設置一組獨立的sgRNA序列，組中包含識別片段上游切割位點的sgRNA序列及識別片段下游切割位點的sgRNA序列，每組sgRNA序列利用DR序列串聯形成一個sgRNA陣列；
(3)合成包含敲除文庫全部所需sgRNA陣列的Oligo pool，擴增Oligo pool，得到包含敲除文庫全部所需sgRNA陣列的雙鏈DNA片段；
(4)將(3)中得到的雙鏈DNA片段與BsmB Ⅰ酶切后的慢病毒載體進行同源重組酶重組連接，得到第二載體，用感受態細胞進行電擊轉化；
(5)獲得大于sgRNA文庫庫容的轉化菌落數量后，收獲第二載體，包裝制備慢病毒，轉導步驟(1)構建得到的細胞系。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述Cpf1酶為enAsCas12a。
6.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述DNA片段為編碼基因、非編碼RNA、miRNA、甲基化島、啟動子或增強子中的一種或多種。
7.權利要求1-4任一所述方法在功能基因篩選中的應用。
8.根據權利要求3-4任一所述的方法，其特征在于，所述第一載體含有啟動子、編碼Cpf1酶的序列、篩選元件。
9.根據權利要求3-4任一所述的方法，其特征在于，所述第二載體含有與第一啟動子相連的sgRNA陣列和與第二啟動子相連的標記基因。
10.使用權利要求4所述方法構建得到的真核細胞基因敲除文庫。
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