[發(fā)明專利]一種通過CRISPR/Cas9制備的豬偽狂犬病弱毒株及其應用

有效

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• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112342201B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設計）人: 徐高原;張華偉;侯真真;周明光;郝根喜;陳波;金建云;陳章表;方玉林
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/113;C12N15/11;C12Q1/70;A61K39/25;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 錢云

本發(fā)明涉及一種通過CRISPR/Cas9制備的豬偽狂犬病弱毒株及其應用。本發(fā)明通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬偽狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段得到一種豬偽狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB?1，經(jīng)實驗驗證，豬偽狂犬病弱毒株HB?1在保留了免疫原性的同時，毒性大幅度降低，在制備成疫苗后安全性好，不會引起仔豬發(fā)病，同時經(jīng)過免疫接種后，對仔豬的保護率達到100％。本發(fā)明提供的豬偽狂犬病弱毒株HB?1為臨床上針對豬偽狂犬病的防控以及豬偽狂犬病病毒在豬群中的清除提供物質(zhì)基礎和技術支撐，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及獸用生物制品技術領域，尤其涉及一種通過CRISPR/Cas9制備的豬偽狂犬病弱毒株及其應用。

背景技術

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種高度接觸性傳染病。該病多發(fā)生于寒冷、氣溫多變的春、冬季，有一定的季節(jié)性。豬偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬，基因組為線性雙鏈DNA，可編碼70～100種蛋白質(zhì)。US7與US8基因形成復合體US7/US8，與病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的侵襲和擴散密切相關，是影響PRV生長的功能成分。US9是一個C-末端錨定的Ⅱ型膜蛋白，是PRV順行傳導的基因。US2是病毒復制的非必需基因，對PRV噬斑形成至關重要。

目前，對豬偽狂犬病的防控，主要是通過疫苗接種預防?，F(xiàn)有技術已研制出豬偽狂犬病的常規(guī)弱毒疫苗、滅活疫苗、基因缺失弱毒疫苗和基因缺失滅活疫苗，而病毒載體重組疫苗和基因疫苗尚處于實驗室研究階段。基因缺失疫苗已經(jīng)在生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，尤其在美國和歐洲一些發(fā)達國家的PRV根除計劃中功不可沒。豬偽狂犬病毒基因缺失疫苗的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在毒力基因缺失，安全性高，不易發(fā)生毒力返強，能誘導體液免疫和細胞免疫，免疫原性強，保護時間長；可用于疫苗免疫動物與自然感染動物的鑒別診斷。

豬偽狂犬病病毒是引起豬偽狂犬病的病原，能感染不同年齡段豬只，導致流產(chǎn)、死胎、種豬不育、斷奶仔豬和育肥仔豬呼吸癥狀，對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的危害。由于豬偽狂犬病病毒的變異，豬偽狂犬病難以得到有效控制，帶來巨大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)經(jīng)典弱毒活疫苗PRV Bartha K61不能針對當前流行性PRV變異毒株提供完全免疫保護。為了防控當前流行的偽狂犬病，快速研制針對當前流行的PRV變異毒株的疫苗成為疫苗研發(fā)工作的當務之急。

發(fā)明內(nèi)容

為了至少解決一種現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種通過CRISPR/Cas9制備的豬偽狂犬病弱毒株及其應用，該基因缺失弱毒株在保留豬偽狂犬病毒株免疫原性的同時較高程度上降低了其毒力，安全性高，對PRV變異株具有良好的免疫保護效果，可作為防治偽狂犬病疫苗候選株。

此外，本發(fā)明使用CRISPR/Cas9高效的基因編輯工具技術對當前流行的PRV變異毒株進行快速基因編輯，敲除了豬偽狂犬病病毒PRV HB株US7、US8、US9和US2四個基因，構建四基因缺失弱毒疫苗的候選株PRV HB-1株(△US7/US8/US9/US2)。該方法相較于傳統(tǒng)的同源重組方法，大幅度提高了基因編輯效率，縮短疫苗研發(fā)周期，更好地預防當前流行毒株。現(xiàn)有技術目前常采用低溫傳代和藥物篩選致弱快速制備豬偽狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株的方法，但是這些方法操作繁瑣、研發(fā)周期長、重組效率相對較低；與本技術相比，工作量加倍，并且需對培養(yǎng)箱持續(xù)降溫，以達到基因缺失的目的，與本方案使用sgRNA相比，敲除效率相對較低。

本發(fā)明豬偽狂犬基因缺失弱毒株HB-1接種偽狂犬陰性仔豬后，所有仔豬臨床癥狀均表現(xiàn)正常，且產(chǎn)生較高的中和抗體水平，即該毒株作為疫苗接種仔豬能夠產(chǎn)生有效保護，說明該豬偽狂犬基因缺失HB-1株能夠作為防治偽狂犬病的疫苗候選株。

本發(fā)明對得到的豬偽狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1進行了生物保藏，其保藏信息如下：