[發明專利]一種用于烯酸檢測的分光光度法

在審

• 申請號: 202011216539.2
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112557312A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 應向賢;曾茵;馮彬斌;汪釗
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/38
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種用于烯酸檢測的分光光度法，以KMnO₄為氧化劑和顯色劑，以烯酸為底物，以超純水為反應介質構成顯色反應體系，在20?40℃反應1?10min，測試顯色反應液520?540nm處吸光值，根據同樣條件下制作的烯酸濃度與吸光值的標準曲線獲得顯色反應液中烯酸含量。本發明分光光度法適用于丙烯酸、E?2?戊烯酸、巴豆酸、富馬酸和E?肉桂酸等多種不飽和有機酸的定性和定量分析。此外，該分光光度法應用于丙烯酸氨化酶和天冬氨酸氨裂解酶的活力篩選，既可以通過酶標儀精確分析，也可以基于變色反應目測判別，具有簡單、快速、經濟、結果直觀等諸多優點。

(一)技術領域

本發明涉及一種用于烯酸分析的分光光度法及其在烯酸氨化酶和氨基酸氨裂解酶的活力篩選中的應用，屬于生物產品分析領域。

(二)背景技術

烯酸類化合物具有C＝C和C＝O，其中C＝C可發生聚合、加成或氧化反應，C＝O可以生成酯、酰胺、酰氯、酸酐等，因此在有機合成中有著十分重要的作用。重要的不飽和有機酸包括丙烯酸、E-2-戊烯酸、巴豆酸、富馬酸和E-肉桂酸等。丙烯酸作為最簡單的不飽和有機酸，是工業合成中的重要底物。丙烯酸的C＝C選擇性加氨可生成β-丙氨酸，而β-丙氨酸是在醫藥、食品、化工、飼料等方面有廣泛應用，是合成泛酸和泛酸鈣、肌肽等的重要前體。

目前β-丙氨酸的生產方法以化學合成法為主，存在高污染、高能耗、反應條件苛刻等不足。本課題組致力于開發綠色環保的的生物法替代化學法合成β-丙氨酸，利用蛋白質工程技術改造天冬氨酸氨裂解酶使其轉變為丙烯酸氨化酶，該突變酶催化丙烯酸選擇性加氨生成β-丙氨酸。對天冬氨酸氨裂解酶的蛋白質工程改造和丙烯酸氨化酶催化性能的進一步強化，涉及到大量的丙烯酸氨化酶和天冬氨酸氨裂解酶篩選工作。當前天冬氨酸氨裂解酶和丙烯酸氨化酶的活力檢測是基于底物和和產物的量的變化。通過高效液相色譜分析底物和產物(包括丙烯酸、β-丙氨酸、天冬氨酸和富馬酸等)，雖然測量精確，數據可靠，然而每個樣品分析至少耗時十五分鐘，難以實現天冬氨酸氨裂解酶和丙烯酸氨化酶的快速高效篩選。因此，開發天冬氨酸氨裂解酶和丙烯酸氨化酶的快速篩選方法具有重要的意義。

KMnO₄是常規且有效的C＝C氧化裂解的試劑之一，KMnO₄氧化烯酸的C＝C的同時自身被還原為K₂MnO₄，在酸性、中性和弱堿性環境下，K₂MnO₄發生歧化反應生成KMnO₄和MnO₂。基于此原理，建立KMnO₄氧化烯酸導致的吸光值變化與烯酸之間量的關系，進一步地，關聯烯酸氨化反應和氨基酸氨裂解反應中烯酸量的大小與氨化酶和氨裂解酶的活力高低，最終形成適用于天冬氨酸氨裂解酶和丙烯酸氨化酶的快速篩選方法。目前尚未見相關的分光光度法和酶活力篩選方法報道。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種用于烯酸檢測的分光光度法，利用分光光度法篩選烯酸氨化酶和氨基酸氨裂解酶，特別是丙烯酸氨化酶和天冬氨酸氨裂解酶的快速活力篩選，填補了沒有丙烯酸氨化酶和天冬氨酸氨裂解酶的快速活力篩選方法的空白。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種用于烯酸檢測的分光光度法，所述方法為：以KMnO₄為氧化劑和顯色劑，以烯酸為底物，以超純水為反應介質構成顯色反應體系，在20-40℃反應1-10min(優選37℃下反應4min)，測試顯色反應液520-540nm(優選540nm)處吸光值，根據同樣條件下制作的烯酸濃度與吸光值的標準曲線獲得顯色反應液中烯酸含量。

進一步，所述KMnO₄加入終濃度0.001-2mM(優選0.9mM)。所述烯酸加入終濃度為0.1-2.0mM(優選0.6mM)。

進一步，所述烯酸包括丙烯酸、E-2-戊烯酸、巴豆酸、富馬酸或E-肉桂酸。