[發明專利]新冠重組RBD蛋白在昆蟲細胞中的生產方法

在審

• 申請號: 202011216438.5
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112359063A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 雍金貴;李森;王方平;鄒剛剛
• 申請（專利權）人: 安徽環球基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K14/165
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 周衛

1.新冠重組RBD蛋白在昆蟲細胞中的生產方法，其特征在于：具體包括如下步驟：

步驟一、載體構建：密碼子優化后通過基因合成技術將重組RBD基因亞克隆克隆到pFastbac1中；

步驟二、DH10Bac感受態細胞制備：取DH10Bac菌株，對DH10Bac菌株平板劃線至雙抗LB平板中，雙抗LB平板中含有濃度為50μg/mg kanamycin sulfate和10μg/mg tetracyclinehydrochloride；

步驟三、轉座：準備含三抗顯色LB平板，其中三抗顯色LB平板中含有50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride、7μg/mg gentamicinsulphate、40μg/mg IPTG與100μg/mg X-Gal，將三抗顯色LB平板轉座至DH10Bac感受態中，進行藍白斑篩選，PCR技術篩選出陽性單克隆菌落后制備Bacmid質粒；

步驟四、桿粒的抽提與驗證：在無菌的24孔搖菌板中加入4mL三抗LB培養基，在培養后的三抗顯色板中挑取白色單克隆菌落數個分別放入搖菌板中，在溫度為37℃轉速為220rpm的條件下培養過夜，拿出搖菌板，取2mL的培養物分別加至2.0mL離心管中，向離心管中加入50μL無菌ddH₂O，充分溶解沉淀，即為昆蟲桿狀病毒質粒溶液，簡稱桿粒，得到新冠重組RBD蛋白。

2.根據權利要求1所述的新冠重組RBD蛋白在昆蟲細胞中的生產方法，其特征在于：所述RBD基因表達的序列：

MKLCILLAVVAFVGLSLGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN*。

3.根據權利要求1所述的新冠重組RBD蛋白在昆蟲細胞中的生產方法，其特征在于：所述DH10Bac感受態細胞制備的具體步驟如下：將雙抗LB平板放置在溫度為37℃條件下培養過夜，取3支含4mL無菌LB的試管，向3支試管中統一加入終濃度50μg/mg kanamycinsulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride，分別將3支試管內部的溶液進行混勻，挑取3個單克隆分別轉接至3支試管中，對3支試管均放置在溫度為37℃轉速為220rpm的條件下培養過夜，取1個含400mL無菌LB的三角瓶，向三角瓶中加入終濃度50μL/mg kanamycinsulfate、10μL/mg tetracycline hydrochloride，混勻，取出3支試管培養物，比較每支長勢，取1支長勢正常的培養物，全部接種至三角瓶中，在溫度為37℃轉速為220rpm的條件下培養至OD₆₀₀＝0.4-0.6，立即將三角瓶放入冰水混合物中靜置30min，以停止細菌的生長，對離心機進行預冷至4℃，在溫度為4℃轉速為3000rpm的條件下離心10min，棄上清，加100mL預冷的0.2M CaCl₂重懸沉淀，立即放入冰水混合物中靜置30min，接著重復上一步驟一次，離心機預冷至4℃，在溫度為4℃轉速為3000rpm的條件下離心10min，棄上清，加10mL預冷的感受態儲存液0.2M CaCl₂和20％Glycerol，在重懸沉淀后分裝至預冷的無菌1.5mL離心管中，在100μL/vial，-80℃條件下保存待用。