[發明專利]重組新型冠狀病毒亞單位疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 202011216187.0
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112089831B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 畢勝利;侯云德;毛江森;高福;武桂珍;秦川;許文波;毛子安;蘇秋東;伊瑤;高孟;陳剛;莊昉成;呂杭軍;陸紹紅
• 申請（專利權）人: 浙江普康生物技術股份有限公司;中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所;杭州醫學院;中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
• 主分類號: A61K39/215
• 分類號: A61K39/215;A61K39/39;A61P31/14;C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 杭州華進聯浙知識產權代理有限公司 33250
• 代理人: 儲照良

1.一種重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，包括：

a）將含有SEQ ID NO：2所示的核酸片段的質粒轉染到大腸桿菌，所述核酸片段能夠表達RBD-TT融合蛋白；

b）培養所述大腸桿菌，使其表達所述RBD-TT融合蛋白，破碎菌體并分離所述RBD-TT重組蛋白的包涵體粗提物；

c）將所述包涵體粗提物用含尿素的變性液溶解后，通過陰離子交換色譜層析進行純化，得到RBD-TT重組蛋白粗純樣品；

d）將所述RBD-TT重組蛋白粗純樣品用稀釋液稀釋；

每升所述稀釋液中含有：尿素450~510克，精氨酸70~86克，還原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，和緩沖物質，pH=9~10；

e）所述稀釋后的RBD-TT重組蛋白依次用復性液1、復性液2、復性液3進行透析置換或切向流超濾復性；

所述每升復性液1中含有：精氨酸70~86克，還原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸鈉1~3克，碳酸氫鈉3~6克，pH=9~10；

所述每升復性液2中含有：還原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸鈉1~3克，碳酸氫鈉3~6克，pH=9~10；

所述每升復性液3中含有：還原性谷胱甘肽0.1~0.3克，碳酸鈉0.5~1克，碳酸氫鈉1~2克，pH=9~10；

f）將復性后的蛋白通過陰離子交換色譜層析進行純化。

2.根據權利要求1所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，每次透析置換所用復性液與蛋白液的透析置換體積比均獨立地選自1：（50~1000），每次置換時間為4~6小時。

3.根據權利要求2所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述透析置換所用透析袋孔徑為5kd~30kd。

4.根據權利要求1所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，每次切向流超濾復性所用復性液與蛋白液的超濾置換體積比獨立地選自1：（2~5），每次切向流超濾進料壓力為20 bar~30bar。

5.根據權利要求4所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述切向流超濾復性所用的切向流超濾膜包的孔徑大小為5kd~30kd。

6.根據權利要求1所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，在步驟c）和f）中，所述陰離子交換色譜的交換基團包括二乙胺乙基或季氨基。

7.根據權利要求1所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，在步驟d）中，按所述RBD-TT重組蛋白粗純樣品和所述稀釋液體積比1：（1～10）進行稀釋。

8.根據權利要求1所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述質粒為pET28a大腸桿菌表達質粒。

9.根據權利要求1所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，每升所述變性液中含有：氯化鈉17~23克，尿素450~510克，和緩沖物質，pH=7.2~7.8。

10.根據權利要求1或9所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述緩沖物質為三羥甲基氨基甲烷。

11.根據權利要求1~9任一項所述的重組SARS-CoV-2亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，在步驟b）中，培養所述大腸桿菌至對數生長期，在25℃~37℃溫度條件下采用0.7mM~1.3mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導劑誘導大腸桿菌4~24小時，使其表達所述RBD-TT融合蛋白。