[發明專利]一種法氏囊七肽及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011215696.1
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112409454B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 劉曉東;董旭峰;王述柏;劉旭;秦志華
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/14;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;A61K38/08;A61P37/04
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 盛君梅

本發明公開了一種從法氏囊中發現一種新的七肽，氨基酸序列為SEQ ID NO:1 APKPRKK，該七肽是第一次從禽類的中樞體液免疫器官中分離出來。本發明還提供了上述法氏囊七肽的分離方法。本發明提供的法氏囊七肽在實驗動物體內具有明顯的免疫調節作用，法氏囊七肽對體液免疫具有誘導效應(如調節抗體的產生和分型。

技術領域：

本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及一種具有免疫調節作用的法氏囊七肽，及其在免疫中的應用。

背景技術：

法氏囊(bursa of Fabricus，BF)最早是由Hieronymus Fabricus于1961年發現，同時并明確了腔上囊的形態和位置，由此而命名為bursa of Fabricus。法氏囊是禽類特有的體液免疫的中樞淋巴器官，位于泄殖腔背側，其盲端呈囊狀，朝向軀體前端，頸部以短柄朝向軀體后下方，開口于泄殖腔。早期的研究者觀察到法氏囊隨性成熟而逐漸退化，所以一直認為它是與生殖生理有關的器官。自1956年，Glick等發現摘除法氏囊會降低雛雞對沙門氏菌“O”抗原的抗體生成以來，法氏囊被人們確認為禽類特有的中樞淋巴器官，是B細胞的最早發生場所，B細胞由它遷移到外周淋巴器官定居和繁衍，執行免疫功能。

1960年，Glick等報道了注射6次丙酮處理9小時法氏囊粗提物的生理鹽水懸液，可以提高摘除法氏囊的雛雞對綿羊紅細胞(SRBC)的抗體水平。Baba等1976年報道用雞法氏囊提取液給切除法氏囊的雛雞注射后，可使這些雞獲得產生IgG的能力并提高抗體水平。1976年，Brand發現法氏囊提取物能誘導雛雞骨髓細胞表達Th-1抗原，并還存在有促進早期B細胞表達Bu-1抗原的因子，而且囊提取液濃度越低，對誘導B細胞分化的能力就越強。1981年，高舜德等進行了雞胚法氏囊提取液對法氏囊復生的研究。1982年，Eerola等報道了由體外培養的法氏囊上皮細胞及無血清的培養上清具有促進B淋巴細胞分化的生物學特性。Audhya等在1986年首次報道了從160g雞的法氏囊中分離到1.3mg囊素(bursin，BS)。經質譜鑒定分析，認為得到BS是一種三肽排列結構的物質，其氨基酸組成順序為Lys-His-Gly-NH2，其中Lys∶His∶Gly∶NH2為1∶0.9∶1∶0.8，并證明它能誘導B細胞前體的分化，且能特異性地提高人Daudi B細胞中cAMP和cGMP的水平，而對T細胞較弱。當用濃度為100ug/ml的BS進行刺激時，B淋巴細胞內的cAMP和cGMP的水平可達最高值8-15pmol/ml，而對T淋巴細胞則只能使其cGMP水平升高，不能使其cAMP水平升高。這是從法氏囊得到且有關B細胞發育的第一個結構明確的活性因子。

在公開號為CN109134613A和CN101830968A的中國發明專利申請中分別發現了具有免疫增強功能的兩種法氏囊七肽BP7。

發明內容：

本發明首次發現了一條新的法氏囊七肽，與前面發現的兩種法氏囊七肽相比，此次發現的BP7除能顯著提高疫苗免疫效力，還能明顯促進B細胞的分化，本申請提供了一種天然法氏囊七肽。

本發明提供如下技術方案：

本發明提供了一種新型法氏囊七肽，氨基酸序列為SEQ ID NO:1APKPRKK。

本發明還提供了上述法氏囊七肽的制備方法，包括：

1)取健康青年雞的法氏囊組織，于生理鹽水中碾碎，以g:ml計，法氏囊與生理鹽水的比例為2：3；反復凍融三次，并在0-10℃下10000-16000g離心60分鐘，采用截流分子量為1000Da的超濾膜過濾，真空冷凍干燥，得法氏囊七肽凍干樣品；

2)凍干樣品以PBS稀釋，12000g離心10分鐘，經0.22μm濾膜過濾，并凍干，得二次凍干樣品；

3)二次凍干樣品用B液稀釋，12000g離心10分鐘，然后用0.22um濾膜過濾；取濾液經反向高效液相純化分析，收獲滯留時間為10鐘的活性峰，即得；所述B液為含有2％乙腈和0.065％三氟乙酸的水溶液。