[發明專利]一種甾體5β還原酶變體及其用途

在審

• 申請號: 202011215626.6
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112280758A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 齊福平;李園園
• 申請（專利權）人: 沈陽博泰生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P33/00
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發明涉及一種甾體5β還原酶變體及其用途。所述甾體5β還原酶變體具有甾體5β還原酶活性，其氨基酸序列包含R63K和R64H突變，能夠利用NADH為輔酶，且具有選自以下的氨基酸序列：1)SEQ ID NO:1、3或5所示氨基酸序列；2)SEQ ID NO:1、3或5所示氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列；或3)與SEQ ID NO:1、3或5具有69％以上序列同一性的氨基酸序列。所述甾體5β還原酶變體的轉化產物構象單一，只有β型還原產物出現，具有空間加氫特異性，產物中無α型結構，具有高效、穩定的特點。

技術領域

本發明涉及基因工程和酶工程領域，更具體而言，本發明涉及一種甾體5β還原酶變體及其用途。

背景技術

甾體藥物是廣泛應用于臨床的一大類藥物，其大致分為類皮質激素和性激素兩大類，對機體起著非常重要的調節作用，在醫藥工業中占有重要的地位。甾體藥物的發現及成功合成是近半個世紀以來醫藥工業取得的最引人注目的兩大進展之一。然而，利用化學法合成時，往往合成步驟多，效率低，價格昂貴。1950年Murray和Peterson利用黑根霉高效轉化黃體酮為11α-羥基黃體酮，使從孕酮合成皮質酮只需要3步，這一研究成果引起了微生物學者的極大興趣，此后開展了大量的微生物對甾體轉化的研究工作。

有別于甾體化合物結構中的5α氫，膽酸類化合物5位上的氫為5β，是一個重要的化學結構，其化學合成難度大，急需高效專一的生物轉化法。文獻報道，所有甾體5β還原酶均以NADPH為輔酶(Herl V,Fischer G,Reva VA,Stiebritz M,Muller YA,Müller-Uri F,Kreis W:The VEP1 gene(At4g24220)encodes a short-chain dehydrogenase/reductasewith3-oxo-Delta4,5-steroid 5beta-reductase activity in Arabidopsis thalianaL.Biochimie 2009,91(4):517-525.)，但是在實際工業生產中由于NADPH穩定性差，價格昂貴，不能工業化應用。

由于自然存在的酶在工業生產上會存在很多問題，例如對底物催化緩慢，穩定性差，或生產成本高等，不適用于工業應用。而對于甾體5β還原酶類，考慮最多的是酶對底物的催化速度和輔酶的選擇性。因此，需要深入了解甾體5β還原酶的輔酶特異性問題。若甾體5β還原酶能夠以NADH為輔酶，則將可以克服這些困難，因此甾體5β還原酶利用的輔酶由NADPH轉變為NADH的研究具有重大應用價值。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷與不足，提供了一種甾體5β還原酶的變體，該變體的輔酶特異性由穩定性差的NADPH改變為價格低廉、性質穩定的NADH，該變體具有高效、穩定的特點，能夠大大降低實際工業生產的成本。

不受具體理論約束，本發明提供的甾體5β還原酶變體將甾體轉化為5β-甾體的方程式如下：

其中，R可為任何取代基，如羥丙基或乙酰基。

本發明通過對甾體5β還原酶進行改造，獲得了一種甾體5β還原酶變體，所述甾體5β還原酶變體的氨基酸序列包括兩個相鄰位點的RR突變為相鄰的KH。優選地，該變體的SEQID NO:1、3或5所示氨基酸序列具有R63K和R64H突變(R63K/R64H)。該突變使得甾體5β還原酶可利用NADPH和NADH為輔酶。

本發明提供了一種具有甾體5β還原酶活性的甾體5β還原酶變體，所述甾體5β還原酶變體的氨基酸序列包含R63K和R64H突變，能夠利用NADH為輔酶，且具有選自以下的氨基酸序列：

1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；