[發明專利]一種重組IL2在畢赤酵母中的生產方法

在審

• 申請號: 202011211680.3
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112358540A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 雍金貴;王方平;潘楠;鮑偉
• 申請（專利權）人: 安徽環球基因科技有限公司
• 主分類號: C07K14/55
• 分類號: C07K14/55;C12N15/81;C12N1/19;C07K1/20;C12R1/84
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 周衛

本發明公開了一種重組IL2在畢赤酵母中的生產方法，包括如下步驟：步驟S1：重組質粒構建；步驟S2：感受態細胞制備；步驟S3：質粒的線性化；步驟S4：電轉化；步驟S5：陽性克隆的菌落PCR鑒定及克隆的小量轉接；步驟S6：陽性克隆的誘導及小量表達測試；步驟S7：放大純化；在基因合成的過程中對IL2的基因進行了密碼子的優化，且后期的表達小試進行了最優克隆的篩選及最優表達時間的優化，因此極大地提高了該蛋白的表達量，在載體構建中使用了無縫克隆的技術，從而使得重組IL2在pPICZαA載體中表達出tag free蛋白，后期使用疏水相互作用層析，縮短純化流程，低溫操作，從而極大地保障了蛋白活性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組IL2在畢赤酵母中的生產方法。

背景技術

白細胞介素是由多種細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子。由于最初是由白細胞產生又在白細胞間發揮作用，所以由此得名，現仍一直沿用。最初指由白細胞產生又在白細胞間起調節作用的細胞因子，現指一類分子結構和生物學功能已基本明確，具有重要調節作用而統一命名的細胞因子，它和血細胞生長因子同屬細胞因子。兩者相互協調，相互作用，共同完成造血和免疫調節功能，白細胞介素在傳遞信息，激活與調節免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應中起重要作用，白細胞介素interleukin縮寫為IL，功能關系免疫反應的表達和調節，這種調節有來源于淋巴細胞或巨噬細胞等的許多因子參與。來源于淋巴細胞的有淋巴細胞活素，來源于巨噬細胞的總稱為monokine，其中的各個因子的生物活性各有不同(例如巨噬細胞活化，促進T細胞繁殖等)，因子自身的物理化學性質多不清楚，本研究通過畢赤酵母成功表達并純化得到重組IL2，為該蛋白的后續的研究奠定了基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組IL2在畢赤酵母中的生產方法。

本發明要解決的技術問題：

現有的重組IL2在制備過程中蛋白表達量低，且純化時間較長，純化效果一般。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種重組IL2在畢赤酵母中的生產方法，包括如下步驟：

步驟S1：重組質粒構建；

步驟S2：感受態細胞制備；

步驟S3：質粒的線性化；

步驟S4：電轉化；

步驟S5：陽性克隆的菌落PCR鑒定及克隆的小量轉接；

步驟S6：陽性克隆的誘導及小量表達測試；

步驟S7：放大純化。

進一步，步驟S1的具體步驟如下：

步驟S11：通過基因合成技術將重組IL2密碼子優化后亞克隆至pPICZαA中，構建重組IL2質粒；

重組IL2質粒的基因序列為：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLCLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTVD*。

進一步，步驟S2的具體步驟如下：