[發明專利]檢測小腸結腸耶爾森菌的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202011207733.4
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112111590A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 申進玲;蔣原;郭德華;趙麗娜;楊捷琳
• 申請（專利權）人: 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發明提供了一種檢測小腸結腸耶爾森菌的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法，引物的序列中上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示；探針的序列為如SEQ ID NO.3所示；試劑盒包括上述引物、探針、緩沖液和純化水，RAA檢測方法包括如下步驟：提取樣品DNA，以樣品DNA為模板，利用試劑盒進行RAA擴增，并在擴增過程中進行實時熒光檢測；本發明的實時熒光RAA檢測方法特異性達100％，與其他物種無交叉反應，靈敏度達5.2×10²cfu/mL，5min可得到結果，比實時熒光PCR方法更快速，便捷環保，從而適用于基層實驗室對食品中小腸結腸耶爾森菌的快速檢測。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種檢測小腸結腸耶爾森菌的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法。

背景技術

小腸結腸炎耶爾森菌廣泛分布在自然界，具有“嗜冷性”，在水中和低溫下(4℃)能生長，為腸道中能在4℃生長繁殖的少數細菌之一。野生動物、家畜(豬、狗和貓)、牡蠣和水源中均能檢出，可通過污染食物(牛奶、豬肉等)和水經糞-口途徑感染或因接觸感染動物而感染。除引起胃腸道癥狀外，它還能引起呼吸系統、心血管系統和骨骼結締組織等疾患，甚至可引起敗血癥，造成死亡。該菌還是重要的食源性致病菌，很多國家都已將該菌列為進出口食品的常規檢測項目。目前，傳統的小腸結腸耶爾森菌檢測方法依賴形態及生化特性，因此存在操作復雜繁瑣、檢測周期長、自動化程度低和無法批量化處理等缺點，難以滿足短保質期食品快速放行、現場執法監管、食品安全突發事件應對處理以及舉辦重大活動時快速檢測的需求。近年來，基于免疫和核酸的各種快速檢測方法發展起來，免疫方法特異性和靈敏度較差，而基于核酸的方法具有快速、靈敏、準確等優點，主要以實時熒光PCR法為主。然而，實時熒光PCR基于熱循環儀，儀器昂貴，且對操作人員要求高，因此在基層實驗室推廣應用較為困難。

實時熒光重組酶等溫核酸擴增技術(Recombinase Aided Amplification,RAA)是新一代核酸分子檢測技術，該技術利用重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶在等溫(37-39℃)條件下進行核酸擴增，結合熒光探針實現即時檢測，是一種精準、方便、快速的核酸檢測技術，實現5min完成檢測輸出結果，比實時熒光PCR技術更快速和便捷。目前尚未有關于小腸結腸耶爾森菌的實時熒光RAA方法。

發明內容

針對現有技術中的不足，本發明的首要目的是提供一種檢測小腸結腸耶爾森菌的實時熒光RAA的引物和探針。

本發明的第二個目的是提供包括上述引物和探針的試劑盒。

本發明的第三個目的是提供利用上述試劑盒的RAA檢測方法

為達到上述首要目的，本發明的解決方案是：

一種檢測小腸結腸耶爾森菌的實時熒光RAA的引物和探針，引物的序列為：

上游引物：TACATTGGATAATGACCCTAAAGGTTTTAAC；SEQ ID NO.1；

下游引物：GAAAGATGGCCCCATTGTTACTGAATAGTAATC；SEQ ID NO.2；

探針的序列為：CCGTTATGAACTCGATGATAACTGGGGAGT(FAM)-THF-AT(BHQ1)-AGGTTCGTTTGCT(C3 spacer)；SEQ ID NO.3。

進一步地，上游引物為31bp，下游引物為33bp，探針為46bp，基因探針共有4個修飾基團，分別為熒光基團、四氫呋喃、淬滅基團和C3-spacer，熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修飾，FAM和BHQ1中間間隔2個堿基，四氫呋喃替換其中一個堿基，C3-sapacer位于3’端末尾。

為達到上述第二個目的，本發明的解決方案是：