[發明專利]杜仲多糖指紋圖譜的構建方法及其標準指紋圖譜

在審

• 申請號: 202011207313.6
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112362776A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 柏雪;張登輝
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 李蕊

1.一種杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)杜仲多糖的提取

將杜仲葉、皮粉碎，過篩，加入石油醚，60-80℃回流脫脂4-6h；然后加水，100℃浸提4-6h，重復一次，合并水提液，過濾，濃縮；然后向濃縮液中加入三氯乙酸溶液，4℃下靜置10-15h，離心，取上清液，加入無水乙醇，4℃下靜置10-15h，再離心，取沉淀，洗滌，干燥，得到杜仲粗多糖；

(2)杜仲多糖樣品衍生化

向杜仲粗多糖中加入三氟乙酸，氮氣封口后100-120℃水解4-6h，旋干，洗滌，再旋干，重復3次，加水得到水解液；向水解液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液，在60-80℃水浴反應80-120min，冷卻后加入HCl溶液，再加入氯仿萃取，取上層液，重復3次，離心，收集上清，過濾，得待測品；

(3)指紋圖譜的建立

采用HPLC法測定色譜圖，色譜條件為色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，柱溫：35℃；檢測波長：250nm；流速：1mL/min，進樣體積：10μL，流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0.1mol/L磷酸緩沖鹽溶液，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，選擇自動匹配、平均數算法生成指紋圖譜對照圖譜；

其中，通過PMP衍生物的高效液相色譜測定，比較色譜圖，確定共有特征峰為8個，所述的8個共有特征峰以8號峰為參照的相對保留時間的相對標準偏差RSD均小于2％，即：

1號峰相對保留時間為0.43，RSD為0.05％；

2號峰相對保留時間為0.58，RSD為0.07％；

3號峰相對保留時間為0.62，RSD為0.06％；

4號峰相對保留時間為0.71，RSD為0.07％；

5號峰相對保留時間為0.83，RSD為0.02％；

6號峰相對保留時間為0.93，RSD為0.02％；

7號峰相對保留時間為0.96，RSD為0.09％；

8號峰相對保留時間為1.0，RSD為0％。

2.根據權利要求1所述的杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述1號峰對應甘露糖，相對峰面積為0.20％，RSD為2.82％，所述2號峰對應鼠李糖，相對峰面積為0.18％，RSD為2.64％，所述3號峰對應葡萄糖醛酸，相對峰面積為0.10％，RSD為1.87％，所述4號峰對應半乳糖醛酸，相對峰面積為0.72％，RSD為1.16％，所述5號峰對應葡萄糖，相對峰面積為0.79％，RSD為1.23％，所述6號峰對應半乳糖，相對峰面積為1.46％，RSD為0.63％，所述7號峰對應木糖，相對峰面積為0.15％，RSD為1.17％，所述8號峰對應阿拉伯糖，相對峰面積為1.00％，RSD為0.00％。

3.根據權利要求2所述的杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述各單糖根據與杜仲多糖待測品衍生化反應條件及分析條件相同的單糖混標溶液的保留時間對照定性；單糖混合標準溶液的衍生化反應操作同權利要求1步驟(2)所述，將其中“向水解液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液”改為“向單糖混標溶液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液”。

4.根據權利要求3所述的杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述單糖混標溶液由濃度分別為1mg/mL的D(+)-Glc、D-Man、D-(+)-Gal、L-Rha、D-(+)-Xyl、D-Rib、L-Ara、D-GalUA、D-GlcUA、L-Fuc的單糖標準溶液等體積混合而成。

5.根據權利要求1所述的杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述(1)中杜仲與石油醚的比為1g:8-12mL。

6.根據權利要求1所述的杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述(1)中水提中料液比為1:12-15。

7.根據權利要求1所述的杜仲多糖指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述(1)中三氯乙酸的濃度為5-6vt％；杜仲粗多糖與三氯乙酸的體積比為1:1。

8.權利要求1-7中任一項所述的方法構建得到的杜仲多糖指紋圖譜。