[發明專利]抗非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用

有效

• 申請號: 202011206761.4
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112481220B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 鄭海學;張克山;侯景;申超超;張婷;馮濤;田宏;楊帆;朱紫祥;茹毅;黨文;李丹;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;C07K16/08;C12P21/08;G01N33/577;G01N33/569;A61K39/42;A61P31/20
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張立強

本發明屬于生物工程技術領域，涉及抗非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L的單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明采用小鼠腹腔培養和體外細胞培養雜交瘤細胞7D12制備單克隆抗體，效價測定檢測結果表明，本發明雜交瘤細胞株7D12所分泌的單克隆抗體誘導小鼠產生的腹水抗體效價為10⁷，雜交瘤細胞培養上清的效價達到1:1280。本發明制備的單克隆抗體為研究ASFV解旋酶功能及其分子機制積累了關鍵性的生物學材料，基于該單克隆抗體本身生物學特性建立的間接免疫熒光抗原檢測方法為ASFV精準、快速診斷提供了支撐，本發明制備的單克隆抗體能顯著抑制或者阻斷ASFV復制為ASFV預防和治療提供了可能的產品支持。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及抗非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L的單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明還涉及該雜交瘤細胞株和單克隆抗體的應用。

背景技術

非洲豬瘟(ASF virus)是由非洲豬瘟病毒所致的一種烈性動物傳染病，主要感染豬，發病率和死亡率高達100％。其他宿主動物也可攜帶該病毒(軟蜱)。臨床上表現為高溫、皮膚發紺、結膜出血、腹水，并伴有呼吸障礙和神經癥狀，發病率、死亡率均達100％；主要的儲存宿主為脾臟，發病豬脾臟比正常豬脾臟大很多倍。當病變廣泛而嚴重時，豬群生長受阻，需要進行撲殺，導致嚴重經濟損失。同其他痘病毒一樣，ASFV進化而來的免疫逃避機制能幫助病毒在宿主免疫防御條件下生存，形成持續性感染。同時ASFV不同毒株間抗原/免疫靶標多樣性促進了病毒能反復感染同一宿主。

ASFV屬于非洲豬瘟病毒科，亦是唯一成員，是一種雙鏈線性DNA病毒。電鏡下觀察負染標本中，病毒粒子大小200nm，外有脂類囊膜，內有雙股DNA核心，病毒粒子呈20面體，對應有l892～2172個殼粒(每個殼粒直徑為13nm)，中心有1孔，呈六棱鏡狀，殼粒間的距離為7.4nm～8.1nm。ASFV基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，大小170kb～ 190kb。整個基因組含有151個ORF，可以編碼150～200種蛋白質，其中包含5個解旋酶，分別被命名為D1133L、B962L、QP509L、Q706L、A589L，均屬于解旋酶超家族II家族成員。研究證明ASFV的5個解旋酶當中QP509L和Q706L屬于解旋酶超家族IIDEXH/D-box家族中DEAD-box家族成員，并通過基因序列分析間接證明了D1133L為該家族成員。序列分析表明不同ASFV毒株間5個解旋酶的序列相對保守。D1133L基因位于ASFV基因組中心片段上，與BQ96R間隔40kb左右，該基因在病毒DNA開始復制12h后復制，為晚期基因，能夠編碼產生125.847kDa蛋白。

ASF感染常可通過典型的臨床癥狀和流行情況作出初步診斷。但是ASF常與經典豬瘟臨床癥狀相似而相混淆。在此種情況下，實驗室診斷非常必要。因此確診需要通過電鏡負染、血清學方法、病理組織病理學，PCR檢測和限制性片段長度多態性分析(RFLP)以及動物接種等方法進行進一步的實驗室檢驗。研究證實了這些方法的可行性，然而，這些檢測方法在應用時或多或少會受到一些限制，難以及早檢測病原，也不利于大規模的流行病學調查；目前國內外也沒有用于血清學檢測的免疫檢測試劑盒；分子生物學方法特異性高、結果確實，但對實驗條件及操作人員的要求較高，因此多用于實驗室研究，很難進入臨床應用階段。酶免疫測定技術將酶促反應的高效率和免疫反應的高度專一性有機結合起來，具有靈敏度高、特異性強、對儀器設備要求不高、成本低、操作簡便快捷、無放射性污染、自動化程度高、試劑保存時間長等優點，適用于大批量現地檢測工作，將可能成為極具推廣價值的診斷方法。隨著ASFV對養豬業造成的損失逐年增大，廣泛地開展ASFV監測已不可避免，現在還沒有適合全世界通用的ASF檢測標準。在沒有ASFV商品化疫苗的背景下，研制檢測非洲豬瘟的 IFA和ELISA診斷試劑盒對該病的疫情監測、流行病學調查及完善免疫策略等都具有重要意義。

發明內容