[發明專利]一種外周血單個核細胞的分離方法

在審

• 申請號: 202011205233.7
• 申請日: 2020-11-02
• 公開（公告）號: CN112251404A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 劉偉;鄭大學;丁星
• 申請（專利權）人: 貴州北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 深圳市鼎智專利代理事務所(普通合伙) 44411
• 代理人: 曹勇

1.一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

S10：外周血分離：

S101：使用75％酒精對采血管或采血袋進行表面消毒后，傳入已正常運行的凈化工作臺內；

S102：準備一個T75細胞培養瓶，打開瓶蓋，用移液管吸取采血管中的外周血，轉移至T75細胞培養瓶中，吹打混勻；

S103：取1.5ml送檢微生物限度和全血計數，根據轉移體積，60ml至100ml加入20ml羥乙基淀粉，吹打混勻；

S104：標記好分離開始時間，時間達30分鐘，吸取分離后的上清液轉移至兩個50ml離心管中，記錄所吸取的體積；

S105：在室溫下進行離心。

2.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，還包括以下步驟：

S20：血漿分裝：

S201：離心后的外周血上清液(即血漿)用移液管輕輕吸出轉移到50mL離心管中，并進行標記；

S202：取20mL血漿分裝至5個4.5mL凍存管中，每管4mL，多余廢棄；

S203：封口，貼標簽后轉移至凍存盒，將凍存盒置于4℃冰箱暫存；

S204：將冰箱暫存后的血漿轉移至-80℃冰箱或液氮暫存罐中暫存。

3.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，還包括以下步驟：

S30：分離單個核細胞：

S301：離心后的每管細胞沉淀使用0.9％氯化鈉注射液進行稀釋，定容至30mL，并吹打混勻；

S302：將稀釋后的細胞沉淀緩慢鋪加至2個分離液管中，每管添加30mL，保持分離液與稀釋血液界面清晰，并進行標記；

S303：將離心機降速，然后進行離心。

4.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，還包括以下步驟：

S40：第一次離心洗滌：

S401：離心結束后，吸取單個核細胞層至2個50mL離心管中，每個離心管使用0.9％氯化鈉注射液定容至50mL，吹打混勻，標記；

S402：室溫下進行離心。

5.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，還包括以下步驟：

S50：第二次離心洗滌及取樣：

離心結束后，棄上清，將細胞沉淀合并到1個離心管，并使用0.9％氯化鈉注射液定容至50mL，吹打混勻，取樣0.5mL檢測細胞數量和細胞活率，標記。

6.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，在所述的S105中，離心機的離心力為900g，離心時間為15min。

7.根據權利要求2所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，在所述的S203中，血漿在冰箱暫存的時間為12h。

8.根據權利要求3所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，在所述的S301中，稀釋比例為全血體積與稀釋后體積比等于1:1。

9.根據權利要求3所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，在所述的S303中，離心機設置為1檔、600g，室溫離心15min。

10.根據權利要求4所述的一種外周血單個核細胞的分離方法，其特征在于，在所述的S402中，離心機的離心力設置為600g，離心時間為10min。