[發(fā)明專利]一種大蒜開花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011199029.9
• 申請(qǐng)日: 2020-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN113293158A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐啟江;馮秋影;黃云彤;楊琳琳;賀洪軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/02;A01H6/20;C12Q1/6895;C12Q1/6851;G16B30/00
• 代理公司: 哈爾濱市邦杰專利代理事務(wù)所(普通合伙) 23212
• 代理人: 王銳

1.一種大蒜開花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，其特征在于：包括以下步驟：

A)材料準(zhǔn)備：待大蒜初抽薹，用無菌刀片采集花芽、根、假莖、幼葉、蒜皮、蒜薹，液氮冰凍后，分別保存于-80℃冰箱，作為提取總RNA的植物材料；

B)AsSVP基因克隆：

b1)總RNA提取：利用Trizol法提取大蒜花芽總RNA；

b2)cDNA合成：以高質(zhì)量RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA；

b3)基因引物：用18E，AD，AP3，038，041為引物進(jìn)行3’RACE克隆MADS-box基因cDNA，進(jìn)行序列分析；

b4)RACE擴(kuò)增：根據(jù)比對(duì)出的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5’RACE得到基因全長；通過設(shè)計(jì)全長引物克隆基因ORF區(qū)確保拼接正確；

C)生物信息學(xué)分析：

用MEGA6.0等軟件分析AsSVP的序列結(jié)構(gòu)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定大蒜MADS-box基因的進(jìn)化系地位；

使用Bioedit軟件、ExPASy網(wǎng)站提供的ProtParam在線分析軟件分析蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用ProtParamtool在線推測(cè)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量及每種氨基酸所占比例；結(jié)合DNASTAR軟件和在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)AsSVP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；

使用在線分析軟件PSORT對(duì)其AsSVP蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)；

D)MADS-box基因的表達(dá)模式：

利用RT-PCR和RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)，比較分析各基因在花發(fā)育進(jìn)程中的時(shí)空特異表達(dá)模式；

d1)各組織器官的RNA提取：包括根、假莖、嫩葉、鱗莖、花莖、第一發(fā)育期花蕾、第二發(fā)育期花蕾和第三發(fā)育期花蕾；

d2)半定量RT-PCR體系：

RNA(0.5ug)1ul，5×RTbuffer 4ul，Primer oligo dT(10μM)0.5ul，dNTPs(2.5mM)8ul，RNase inhibitor 0.5ul，RTAce 1ul，加ddH₂O至總體積20ul；

按照以下程序進(jìn)行RT反應(yīng)：42℃，30min；99℃，5min；10℃，∞；

d3)半定量PCR擴(kuò)增體系：

cDNA 1ul，半定量上游引物(20μM)0.4ul，半定量下游引物(20μM)0.4ul，Ex TaqPremix 10ul，加ddH₂O至總體積20ul；

Action按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增94℃2min預(yù)變性，94℃30s，55℃30s，72℃30s，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；瓊脂糖電泳檢測(cè)；

AsSVP按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃2min預(yù)變性，94℃30s，53℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；瓊脂糖電泳檢測(cè)；

d4)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系：

cDNA 8.4ul，實(shí)時(shí)定量上游引物(20μM)0.4ul，實(shí)時(shí)定量下游引物(20μM)0.4ul，Green PCRMaster Mix 10ul，加ddH₂O至總體積20ul；

反應(yīng)程序：50℃2min，Stage2：95℃10min，Stage3：95℃15s，60℃1min；Stage4：95℃15s，60℃1min，95℃15s；在Stage3，Step2(60℃，1min)處收集熒光信號(hào)；

E)構(gòu)建AsSVP過表達(dá)載體并農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染擬南芥：

通過Gateway置換把AsSVP的ORF區(qū)連接到pH7WG2D過表達(dá)載體上；

三親雜交法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌侵染擬南芥。

2.一種大蒜開花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析,它的基因堿基序列如SEQ IDNO:1所示。

3.一種大蒜開花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，它的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。