[發(fā)明專利]一種牙髓間充質干細胞凍存液及凍存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011198474.3
• 申請日: 2020-10-31
• 公開（公告）號: CN112167246B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設計）人: 楊瑩
• 申請（專利權）人: 北京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 廣州海藻專利代理事務所(普通合伙) 44386
• 代理人: 張大保

本發(fā)明公開了一種牙髓間充質干細胞凍存液，包括組分A和組分B，組分A為無血清培養(yǎng)基，組分B由以下原料組成：鈦酸納米管、5?磷酸腺苷二鈉、維生素E、1,8?桉葉素、甘油。本發(fā)明的凍存液不添加動物血清，避免了動物血清可能引起的外源性污染。組分B中1,8?桉葉素和甘油協(xié)同作用，保護細胞在接近冰點時細胞內的水分不會結晶，避免細胞內的結構損傷。添加的鈦酸納米管、5?磷酸腺苷二鈉、維生素E，一方面使細胞在液氮中凍存過程中保持一定活性，避免細胞的凋亡；另一方面，在結束凍存后有助于細胞快速復蘇，恢復活性。本發(fā)明還提供了一種牙髓間充質干細胞的凍存方法，采用本發(fā)明的凍存液，無需復雜的程序性降溫，操作簡單。

技術領域

本發(fā)明涉及干細胞領域，尤其涉及一種牙髓間充質干細胞凍存液及凍存方法。

背景技術

牙髓間充質干細胞(DPSCs)是一種具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質干細胞，具有來源豐富、取材安全方便、不涉及倫理學問題、免疫原性低等優(yōu)點，在再生醫(yī)學領域取得了很大進展，具有廣闊的應用前景。同時，DPSCs在適當條件下能被誘導分化為骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經(jīng)組織、肌組織、角膜等多種組織細胞，并能夠被誘導為具有類胚胎干細胞特性的誘導多能干細胞，能夠作為以后多種疾病臨床轉化研究中的種子細胞。目前，已有多個國家建立牙髓干細胞庫以供臨床治療或科學研究需要。

在牙髓間充質干細胞的臨床應用中涉及到牙髓干細胞的凍存，細胞凍存是將37℃培養(yǎng)的細胞，添加營養(yǎng)成分及防凍保護劑DMSO，通過逐漸降溫的方式將細胞長期超低溫凍存于液氮中的過程。凍存過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環(huán)境，有伴隨造成生物性損傷的危險，需要在降溫前加入凍存液作為保護劑。

目前，細胞的凍存除了采用二甲基亞砜(DMSO)對干細胞進行凍存，還會采用普通商品化的培養(yǎng)基或血清進行細胞凍存。目前的這些凍存液在細胞的凍存過程中還是會無法避免地對牙髓干細胞造成一定的損傷，無法保證干細胞的活力，細胞增殖率較低，影響干細胞的臨床利用。

發(fā)明內容

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種牙髓間充質干細胞凍存液采用無血清培養(yǎng)基，并且不添加DMSO，保證凍存的牙髓間充質干的活性，復蘇后的細胞存活率高。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種牙髓間充質干細胞的凍存方法。

本發(fā)明的目的之一采用如下技術方案實現(xiàn)：

一種牙髓間充質干細胞凍存液，包括組分A和組分B，所述組分A為無血清培養(yǎng)基，所述組分B由以下原料組成：鈦酸納米管、5-磷酸腺苷二鈉、維生素E、1,8-桉葉素、甘油。

進一步地，所述組分B中的各原料在凍存液中的濃度為：鈦酸納米管6.5-9.2μg/mL、5-磷酸腺苷二鈉7.8-8.5μg/mL、維生素E1.5-4.5μg/mL、1,8-桉葉素10.2-14.5mg/mL、甘油25-30mg/mL。

進一步地，所述無血清培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。

進一步地，所述鈦酸納米管的直徑為4-10nm，長度為100-500nm，比表面積為200-300m²/g。

本發(fā)明的目的之二采用如下技術方案實現(xiàn)：

一種牙髓間充質干細胞的凍存方法，采用上述凍存液凍存。

進一步地，上述牙髓間充質干細胞的凍存方法，包括以下步驟：

(1)將待凍存的牙髓間充質干細胞采用組分A的無血清培養(yǎng)基重懸，吹打均勻，降溫至4-6℃；

(2)向步驟(1)的混合物中加入組分B，放入-80℃的冷凍環(huán)境中，24h后轉移至液氮中保存，即完成。

進一步地，步驟(1)中重懸后細胞密度為2-4×10⁶個/mL。