[發明專利]一種抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素組合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011196942.3
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112251454B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 石慧;解天慧
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;A61K38/47;A61K38/16;A61P31/04
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 武君

本發明提供了一種抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素組合物及其制備方法和應用，屬于生物工程技術領域。所述內溶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述穿孔素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發明的噬菌體表達的內溶酶Lys 2和穿孔素Hol 2，具有廣譜的殺菌活性，對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都具有較好的抑菌效果，對沙門氏菌具有明顯的殺傷作用，且內溶酶Lys 2具有一個N端酶活結構域，能裂解β?1,4?糖苷鍵，穿孔素Hol 2具有一個保守的結構域，能破壞細胞，并傳遞信息來控制細胞的裂解時間，可用于制備預防、抑制或治療細胞感染的藥物中，在醫療和食品安全領域具有推廣應用價值。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素組合物及其制備方法和應用。

背景技術

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，被認為是胃腸道疾病的主要原因，容易導致沙門氏菌病，具有很高的人畜共患可能性，在動物和人類中造成嚴重和可能致命的感染。大多數人類沙門氏菌感染通常與從包括豬肉、牛肉、羊肉和家禽在內的動物源性污染食品中攝入細菌有關。由于抗生素的不恰當使用，耐藥沙門氏菌感染的發病率不斷增加。耐藥沙門氏菌被列入世界衛生組織(WHO)的優先致病菌名單。在全球范圍內，耐藥沙門氏菌已從不同動物源性食品中分離出來(世衛組織，2014年)，包括可能通過食物鏈傳播給人類的豬源性產品，這已成為一個重大公共衛生問題。耐藥沙門氏菌的廣泛感染對包括中國在內的許多國家的公眾健康構成持續威脅。研究新型抑菌劑被提上日程。

近幾年，噬菌體作為一種新型的抑菌劑開始得到大量的研究。但噬菌體作為活體病毒，不易保存且不容易被人們接受。而具有抑菌作用的內溶酶和穿孔素能很好的解決這些問題。穿孔素和內溶酶在噬菌體裂解細菌中發揮著重要的作用，“穿孔素-內溶酶”裂解體系是dsDNA噬菌體的經典的裂解系統。內溶酶是一種有dsDNA噬菌體編碼的肽聚糖水解酶，降解細菌的肽聚糖，導致細菌死亡。內溶酶具有高效，裂解譜寬，不易產生耐藥性等優點，已經應用于醫療，食品安全，病原菌檢測等各個方面。穿孔素是一種含有跨膜結構的疏水蛋白。在噬菌體裂解細菌過程中，通過在細胞膜上形成孔徑，協助內溶酶與肽聚糖接觸。但現有噬菌體內溶酶和穿孔素的種類很少。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素組合物及其制備方法和應用。

經研究，本發明采用以下技術方案：

1、一種抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素組合物，所述內溶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述穿孔素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述內溶酶的結構域由酰胺酶催化結構域和肽聚糖結合結構域組成。

優選的，所述穿孔素具有一個跨膜結構和一個單獨的結構域。

優選的，編碼所述內溶酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，編碼所述穿孔素的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

優選的，表達所述內溶酶和穿孔素組合物的細胞為原核細胞或真核細胞。

優選的，所述噬菌體為抗沙門氏菌噬菌體。

更優選的，所述沙門氏菌為Salmonella spp.。其中，將抗沙門氏菌噬菌體，抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素分別命名為SM-p 2，Lys 2和Hol 2。

2、一種表達載體，所述表達載體包含如SEQ ID NO:3所示和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

3、上述抗沙門氏菌噬菌體表達的內溶酶和穿孔素組合物的制備方法，包括以下步驟：

1)向污水中加入沙門氏菌，培養后收集上清液，將上清液點斑于雙層瓊脂平板上，純化后得到單一斑塊，向單一斑塊中加入緩沖液，攪拌后靜置，收集液體，離心后加入沙門氏菌菌液中，培養，離心取上清液，富集得到噬菌體；