[發(fā)明專利]一種大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin重組蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011195277.6
• 申請日: 2020-10-31
• 公開（公告）號: CN112226378B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳新華;黎球華;許麗冰;母尹楠;何天良
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C07K14/81;A61K38/57;A61P37/04;C12R1/84
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供一種大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin重組蛋白及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建了高效表達大黃魚Cystatin重組蛋白的畢赤酵母工程菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2020369。利用畢赤酵母工程菌生產(chǎn)的大黃魚Cystatin重組蛋白，可抑制木瓜蛋白酶、大黃魚組織蛋白酶B和S的活性，上調(diào)巨噬細胞內(nèi)炎癥相關(guān)因子TNFα的表達水平，并誘導(dǎo)巨噬細胞中抗菌活性物質(zhì)一氧化氮產(chǎn)生，表明大黃魚Cystatin重組蛋白作為蛋白酶抑制劑和免疫增強劑具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin重組蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatins）是一類與半胱氨酸蛋白酶緊密結(jié)合、可逆的天然抑制劑。它們能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶的功能，保護機體免受來自于自身、細菌或病毒的蛋白酶的破壞性水解，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抗細菌和病毒感染以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用 (Natasˇa Kopitar-Jerala. 2006. The role of cystatins in cells ofthe immune system. FEBS Letters 580: 6295–6301)。根據(jù)定位、大小和多肽鏈復(fù)雜程度不同，半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員分為3種類型：第一個類型是stefins，包括Cystatin A和B，由約98個氨基酸組成，沒有二硫鍵和糖基化，主要分布于細胞內(nèi)；第二個類型是Cystatin，包括Cystatin C、D、E、F等，由約120個氨基酸組成，含有兩個鏈內(nèi)二硫鍵，具有胞外定位的信號肽；第三類是kininogens，主要存在于血漿和哺乳動物的分泌物中，包含3個Cystatin結(jié)構(gòu)域（Josiah Ochieng, Gautam Chaudhuri. 2010. Cystatinsuperfamily. J Health Care Poor Underserved. 21: 51-70）。目前，多種Cystatin基因已經(jīng)在魚類中報道，但是其應(yīng)用性研究仍比較欠缺。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明在于提供一種大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin重組蛋白及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種生產(chǎn)的大黃魚Cystatin重組蛋白的畢赤酵母工程菌，所述工程菌為畢赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin，于2020年7月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2020369，保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

上述工程菌的制備方法為：將如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列克隆到表達載體pPICZαA，電轉(zhuǎn)畢赤酵母后得到工程菌。

利用上述工程菌表達大黃魚Cystatin重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

進一步地，將上述大黃魚Cystatin重組蛋白應(yīng)用于制備蛋白酶抑制劑或者免疫增強劑，所述蛋白酶抑制劑用于抑制木瓜蛋白酶或大黃魚組織蛋白酶B和S的活性；所述免疫增強劑用于上調(diào)巨噬細胞內(nèi)炎癥相關(guān)因子TNFα的表達水平，并誘導(dǎo)巨噬細胞中抗菌活性物質(zhì)一氧化氮的產(chǎn)生。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：利用本發(fā)明畢赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin表達的大黃魚Cystatin重組蛋白不僅能夠抑制多種蛋白酶的活性，而且增強巨噬細胞抗菌功能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的大黃魚Cystatin重組蛋白電泳圖。A，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為含有pPICZαA載體的畢赤酵母工程菌培養(yǎng)液上清；泳道2為畢赤酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-Cystatin培養(yǎng)液上清。B，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為純化的大黃魚Cystatin重組蛋白。