[發明專利]用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法和應用

在審

• 申請號: 202011195027.2
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112415190A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 梁曉;張啟迪;于萬鵬;李金燕
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/558;G01N21/64
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 劉楊

1.一種用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，步驟如下：

(1)制備時間分辨熒光微球偶聯抗體探針：采用表面有羧基修飾的銪-熒光納米微球通過活潑酯法活化微球表面羧基，與尼卡巴嗪單克隆抗體表面的氨基反應形成共價結合的Eu-納米微球探針；

(2)制備時間分辨免疫層析試紙條：將尼卡巴嗪抗原DNC-4-BSA和羊抗雞IgG用劃膜儀依次噴涂NC膜上的檢測線T線和質控線C線位置，將劃好的NC膜烘干，與樣品墊、吸水墊依次粘在底板上；樣品墊和吸水墊在兩端各壓住NC膜2mm；切成寬度為4mm的試紙條，安裝在塑料卡殼里組裝成檢測卡；

(3)檢測：在微孔中加入樣品，再加入步驟1制備的Eu-納米微球探針，吹打混勻，室溫孵育；吸取微孔中混合溶液，加入檢測卡的點樣孔，層析后，進行結果判定。

2.如權利要求1所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，所述結果判定包括，

定性判定法：在紫外儀下觀察，若T和C線均有顏色，則是不含有NIC的陰性樣本；若C線沒顏色、T線有顏色，則是含有NIC的陽性樣本；

定量判定法：使用時間分辨免疫定量分析儀測定T和C線下的熒光強度，T/C為縱坐標，以添加NIC標準品濃度為橫坐標建立標準曲線，進行定量檢測。

3.如權利要求1所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，所述步驟(1)制備時間分辨熒光微球偶聯抗體探針具體方法是：采用一步偶聯法，即將銪-熒光納米微球用活化緩沖液清洗后，加入EDC和NHS活化，活化后再加入尼卡巴嗪單克隆抗體進行偶聯，封閉離心后復溶即得Eu-納米微球探針。

4.如權利要求1或3所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，所述銪-熒光納米微球和尼卡巴嗪單克隆抗體的用量比為5：2。

5.如權利要求2所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，所述標準曲線的建立：按0、0.07、0.19、0.56、1.67、1.37、5、15ng/mL的標準品梯度，建立標準曲線，每個梯度重復3次，取其平均值，以添加濃度為橫坐標，以T/C熒光比值為縱坐標，擬合標準曲線，計算IC₅₀值并確定線性范圍，具體步驟：

(1)吸取0.4μL Eu-納米微球探針溶于120μL不同濃度的尼卡巴嗪標準品溶液中，反復吹打至微孔中白色固體全部溶解；

(2)室溫孵育1min；

(3)吸取100μL微孔中液體，加到試紙條底端樣品墊上，準確反應8min；

(4)將試紙條插入時間分辨免疫熒光分析儀讀數，計算樣品中NIC藥物含量，建立標準曲線。

6.如權利要求5所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，所述標準曲線：NIC的IC₅₀為0.43ng/mL，LOD為0.07ng/mL，檢測范圍分別為0.13-1.37ng/mL。

7.如權利要求1-6任一所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法，其特征是，所述樣品為雞肉經過前處理后的溶液；所述雞肉前處理方法：稱取2.00±0.05g勻漿的雞肉樣品于10mL離心管中，加入2mL乙腈，渦動10min，8000rpm離心10min，取上清用硼酸鹽緩沖液稀釋5倍。

8.權利要求1-7任一所述的用于檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫層析方法在雞肉尼卡巴嗪含量檢測中的應用或在制備檢測尼卡巴嗪的時間分辨熒光免疫試劑卡中的應用。

9.一種尼卡巴嗪時間分辨熒光免疫檢測試劑卡，包括底板和放置在其上的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特征是，所述硝酸纖維素膜提前用DNC-4-BSA和羊抗雞IgG劃好。

10.如權利要求9所述的尼卡巴嗪時間分辨熒光免疫檢測試劑卡，其特征是，所述劃膜方法是：將DNC-4-BSA和羊抗雞IgG用劃膜儀以0.7μL/cm的噴速依次噴涂NC膜上的檢測線T線和質控線C線位置，間距依次是3mm，將劃好的NC膜，放置在37℃烘箱中過夜。