[發(fā)明專利]基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011193028.3
• 申請(qǐng)日: 2020-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN112266979A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王大剛;黃志平;陳圣男;李杰坤;于國(guó)宜;胡國(guó)玉;吳倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 合肥市澤信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34144
• 代理人: 方榮肖

1.一種基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物，其特征在于，所述RPA檢測(cè)引物包括上游引物F以及下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列為：5'-CTTCTATAACATGGCAATTGAAAAGGTTTACTCC-3'；所述下游引物R的核苷酸序列為：5'-CTTCAWTTCTYTTATGCATGTGYACGAACGC-3'。

2.如權(quán)利要求1所述的基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物，其特征在于，所述RPA檢測(cè)引物是基于多條西瓜花葉病毒全基因組序列比對(duì)篩選得到的保守片段設(shè)計(jì)得到的。

3.如權(quán)利要求2所述的基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物，其特征在于，所述設(shè)計(jì)方法為：

通過對(duì)所述多條西瓜花葉病毒全基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)鑒定篩選得到長(zhǎng)度約300bp到500bp的保守片段；

根據(jù)所述保守片段得到所述上游引物F與所述下游引物R。

4.如權(quán)利要求3所述的基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物，其特征在于，所述保守片段的篩選方式為：在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索獲得多條西瓜花葉病毒全基因組序列，所述保守片段包含在每條西瓜花葉病毒全基因組序列中。

5.一種西瓜花葉病毒的RPA快速檢測(cè)方法，其特征在于，其利用如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物來檢測(cè)待測(cè)植物中的西瓜花葉病毒，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄；抽提樣本即所述待測(cè)植物的RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

擴(kuò)增反應(yīng)：以cDNA為模板采用所述RPA檢測(cè)引物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

判斷：所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后判斷所述待測(cè)植物的檢測(cè)結(jié)果是陽性還是陰性。

6.如權(quán)利要求5所述的西瓜花葉病毒的RPA快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系以cDNA∶RPA緩沖液∶上游引物F∶下游引物R∶熒光定量試劑∶雙蒸水∶280mmol/L醋酸鎂溶液按照以下比例混合：2μL∶29.5μL∶2.2μL∶2.2μL∶6.6μL∶5.0μL∶2.5μL；將所述反應(yīng)體系加入到凍干酶粉中。

7.如權(quán)利要求6所述的西瓜花葉病毒的RPA快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增條件：將加有所述反應(yīng)體系的凍干酶粉放入等溫?cái)U(kuò)增熒光反應(yīng)。

8.如權(quán)利要求7所述的西瓜花葉病毒的RPA快速檢測(cè)方法，其特征在于，溫?cái)U(kuò)增熒光反應(yīng)的條件如下：第一步，39℃預(yù)熱40s；第二步，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)39℃持續(xù)30s。

9.如權(quán)利要求5所述的西瓜花葉病毒的RPA快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，如有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，出峰時(shí)間≤15min，Ct值≤35，則判斷為陽性；如無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，出峰時(shí)間15min，Ct值35，判斷為陰性。

10.一種如權(quán)利要求1所述的基于西瓜花葉病毒保守區(qū)域的RPA檢測(cè)引物在制備西瓜花葉病毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。