[發明專利]一種基于微流控技術構建的牙周軟組織仿生芯片及其應用

有效

• 申請號: 202011192879.6
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112300940B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 劉慧穎;馬國武;毛紅菊;靳來娣;安凡;羅勇;林炳承
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12M3/06
• 分類號: C12M3/06;C12N5/071;B01L3/00
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

1.一種基于微流控芯片技術構建的牙周軟組織仿生芯片，其特征在于，從上到下依次包括上層基板（1）、多孔膜（2）和下層基板（3），所述上層基板（1）上設有2條平行的出液微通道a（1-2），上層基板（1）上還設有進液微通道a（1-1），進液微通道a（1-1）與出液微通道a（1-2）垂直形成“土”字狀結構，其中出液微通道a（1-2）的4個端點上各設有一個出液口a（1-3），進液微通道a（1-1）上不與出液微通道a（1-2）相交的端點上設有第一進液口（1-4），2條出液微通道a（1-2）上均分別設有兩個腔室a（1-6），且每條出液微通道a（1-2）上的兩個腔室a（1-6）以進液微通道a（1-1）為對稱軸分布在兩側；

下層基板（3）上設有2條平行的出液微通道b（3-2），下層基板（3）上還設有進液微通道b（3-1），進液微通道b（3-1）與出液微通道b（3-2）垂直形成“土”字狀結構，其中出液微通道b（3-2）的4個端點上各設有一個出液口b（3-3），進液微通道b（3-1）上不與出液微通道b（3-2）相交的端點上設有第三進液口（3-4），2條出液微通道b（3-2）上均分別設有兩個腔室b（3-5），且每條出液微通道b（3-2）上的兩個腔室b（3-5）以進液微通道b（3-1）為對稱軸分布在兩側；

上層基板（1）與下層基板（3）緊密壓緊后，所述進液微通道a（1-1）與進液微通道b（3-1）呈垂直角度，腔室a（1-6）與腔室b（3-5）在豎直方向上完全重合，且腔室a（1-6）與腔室b（3-5）之間均設有多孔膜（2），多孔膜（2）的大小形狀與腔室相同；上層基板（1）上還設有4個出液口c（1-7），出液口c（1-7）位于出液口b（3-3）的豎直方向上的正上方；上層基板（1）上還設有第二進液口（1-5），第二進液口（1-5）位于第三進液口（3-4）的豎直方向上的正上方；

第一進液口（1-4）與進液微通道a（1-1）之間連通；出液微通道a（1-2）、腔室a（1-6）與出液口a（1-3）之間連通；進液微通道a（1-1）與出液微通道a（1-2）的交匯處連通；第三進液口（3-4）與進液微通道b（3-1）之間連通；出液微通道b（3-2）、腔室b（3-5）與出液口b（3-3）之間連通；進液微通道b（3-1）與出液微通道b（3-2）的交匯處連通；

所述上層基板（1）和下層基板（3）的材料包括石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、瓊脂糖、殼聚糖或海藻酸鈉；所述多孔膜（2）的材料包括PDMS、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯，多孔膜（2）的孔徑為0.45μm-10μm；

所述多孔膜（2）的上、下兩表面分別接種牙齦上皮細胞和血管內皮細胞；所述牙齦上皮細胞和血管內皮細胞的來源包括人或任何一種哺乳動物、原代細胞、細胞系以及干細胞誘導分化的功能細胞。

2.根據權利要求1所述的一種基于微流控芯片技術構建的牙周軟組織仿生芯片，其特征在于，所述腔室a（1-6）和腔室b（3-5）的形狀包括圓形、矩形、半圓形和半橢圓形。

3.根據權利要求1所述的一種基于微流控芯片技術構建的牙周軟組織仿生芯片，其特征在于，第二進液口（1-5）和出液口c（1-7）為通孔結構。

4.根據權利要求1所述的一種基于微流控芯片技術構建的牙周軟組織仿生芯片，其特征在于，所述上層基板（1）、多孔膜（2）和下層基板（3）之間可拆卸連接。

5.權利要求1-4中任一項所述的基于微流控芯片技術構建的牙周軟組織仿生芯片的應用，其特征在于，利用牙周軟組織仿生芯片構建牙周軟組織血管屏障模型，應用于細胞共培養、構建細胞屏障、牙周軟組織血管屏障以及功能監測，細胞遷移，藥物篩選。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述牙周軟組織血管屏障模型的構建方法，包括如下步驟：

1）基質膠包被多孔膜

將matrigel基質膠加入盛有多孔膜的培養皿中，將裝有多孔膜和materigel基質膠的培養皿放入細胞培養箱中孵育20-60min凝膠，凝膠過程結束后，磷酸鹽緩沖液清洗至少3遍后待用；

2）細胞接種及牙周軟組織血管屏障模型構建

血管內皮細胞制成懸液，以1×10⁵cell/ml-1×10⁶cell/ml的接種密度接種到包被好的多孔膜的一面上，于細胞培養箱中培養，待血管內皮細胞貼壁后，將接種有血管內皮細胞的多孔膜面朝向腔室b組裝到牙周軟組織仿生芯片上，夾緊固定上層基板和下層基板，通過第二進液口向下層基板注入細胞培養液，使細胞培養液通過第三進液口進入腔室b；將牙齦上皮細胞制成懸液，以1×10⁵cell/ml-1×10⁶cell/ml的接種密度通過第一進液口進入腔室a，將牙周軟組織仿生芯片放入細胞培養箱中培養，培養至細胞融合率達到90%以上，得到牙周軟組織血管屏障模型；

3）牙周軟組織血管屏障模型功能監測

采用血管內皮細胞血管內皮鈣粘蛋白檢測牙周軟組織血管屏障模型屏障功能的完整性，采用FITC標記的右旋糖酐監測牙周軟組織血管屏障模型屏障的通透性。