[發(fā)明專利]重組人促卵泡激素及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011192785.9
• 申請(qǐng)日: 2020-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112195194A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高麗婷;楊仲璠;鮑朋;朱紅雨;張龍章;許可;王丹丹;徐明波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京雙鷺生物技術(shù)有限公司;北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司;北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N15/16;C12P21/02;C07K14/59;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C07K1/34;C07K1/36
• 代理公司: 北京知呱呱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 孫志一

1.一種重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

將構(gòu)建的含F(xiàn)SHα亞基的表達(dá)載體和含F(xiàn)SHβ亞基的表達(dá)載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，純化培養(yǎng)所述細(xì)胞株培養(yǎng)液，得到所述重組人促卵泡激素；其中，所述FSHβ亞基的C末端連接有CTP。

2.如權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述FSHα亞基的編碼區(qū)基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述FSHβ亞基的C末端連接有CTP的編碼區(qū)基因序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述含F(xiàn)SHα亞基的表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程為：

將FSHα亞基基因序列克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1質(zhì)粒獲得FSHα亞基基因，再將酶切后的所述FSHα亞基基因克隆至表達(dá)載體cDNA15.6，通過(guò)所述達(dá)載體cDNA15.6轉(zhuǎn)染DH5α。

4.如權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述含F(xiàn)SHβ亞基的表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程為：

以第一引物、第二引物和FSHβ亞基基因?yàn)槟０錚CR擴(kuò)增，得到FSHβ亞基DNA片段；

以第一引物、第三引物和所述FSHβ亞基基因DNA片段為模板PCR擴(kuò)增，得到FSHβ亞基DNA片段第一延長(zhǎng)段；

以第一引物、第四引物和所述FSHβ亞基基因DNA片段延長(zhǎng)段為模板PCR擴(kuò)增，得到FSHβ亞基DNA片段第二延長(zhǎng)段；

以第一引物、第五引物和所述FSHβ亞基DNA片段第二延長(zhǎng)段為模板PCR擴(kuò)增，得到C末端連接有CTP的FSHβ亞基基因；

將所述C末端連接有CTP的FSHβ亞基基因克隆至表達(dá)載pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1質(zhì)粒獲得FSHβ亞基基因，再將酶切后的所述FSHβ亞基基因克隆至表達(dá)載體cDNA15.6，通過(guò)所述達(dá)載體cDNA15.6轉(zhuǎn)染DH5α；

其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

5.如權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述聯(lián)合轉(zhuǎn)染過(guò)程包括：

將所述含F(xiàn)SHα亞基的表達(dá)載體和含F(xiàn)SHβ亞基的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，得到具有FSHα亞基基因和FSHβ亞基基因的大腸桿菌，再將具有FSHα亞基基因和FSHβ亞基基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞。

6.如權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述純化培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到培養(yǎng)液過(guò)程包括：

將所述培養(yǎng)液的上清液經(jīng)過(guò)親和層析、疏水層析、混合模式層析、陽(yáng)離子層析，將得到的層析液濃縮得到重組人促卵泡激素。

7.如權(quán)利要求6所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述親和層析柱的填料為針對(duì)FSH全分子的特異性CaptureSelect填料；

所述疏水層析柱的填料為Butyl-650M；

所述混合模式層析柱的填料為Capto Adhere；

所述陽(yáng)離子交換層析柱的填料為CM Sepharose Fast Flow。

8.如權(quán)利要求6所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述制備方法還包括：

在上樣陽(yáng)離子交換層析柱之前和過(guò)陽(yáng)離子交換層析柱之后，采用截留分子量為10kD的超濾膜對(duì)所述層析液進(jìn)行超濾濃縮。

9.如權(quán)利要求8所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述超濾濃縮得到濃縮液的濃度為0.8～1.5mg/mL。

10.如權(quán)利要求6所述的重組人促卵泡激素的制備方法，其特征在于，

所述上清液的濁度＜10NTU。