[發(fā)明專利]一種新生豬胰島細胞培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011191695.8
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112251397B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 王維;李桑;谷星石;王佳;方倩
• 申請（專利權）人: 湖南賽諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

1.一種新生豬胰島細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）先在37℃修復培養(yǎng)；

（2）然后在0-8℃低溫培養(yǎng)；

（3）最后在37℃培養(yǎng)。

步驟（1）修復培養(yǎng)12-48h，步驟（3）培養(yǎng)12-24h；步驟（2）培養(yǎng)3-9d；

步驟（2）采用的培養(yǎng)基為EGM-2培養(yǎng)基中添加10%-30% 缺氧豬間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基、5%-15% 人血白蛋白、5%-15% 豬血清、15mM-30mM牛磺酸。

2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2）低溫培養(yǎng)溫度為2-6℃。

3.根據(jù)權利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2）低溫培養(yǎng)溫度為4℃。

4.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2）培養(yǎng)5-9d。

5.根據(jù)權利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2）培養(yǎng)5-7d。

6.根據(jù)權利要求1-5任一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）修復培養(yǎng)12-24h；步驟（3）培養(yǎng)24h。

7.根據(jù)權利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）修復培養(yǎng)24h。

8.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）和（3）是在5%CO₂條件下進行。

9.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）采用胰島細胞普通培養(yǎng)基。

10.根據(jù)權利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）采用Ham's F10培養(yǎng)基或者1640培養(yǎng)基中添加10%-15%豬血清。

11.根據(jù)權利要求10所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）采用1640培養(yǎng)基中添加10%豬血清。

12.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，

步驟（2）采用的培養(yǎng)基為EGM-2培養(yǎng)基中添加30% 缺氧豬間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基、5%人血白蛋白、10% 豬血清和20mM牛磺酸。

13.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（3）采用的培養(yǎng)基為EGM-2培養(yǎng)基中添加5%-15% 豬血清、10%-30% 缺氧豬間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基。

14.根據(jù)權利要求13所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（3）采用的培養(yǎng)基為EGM-2培養(yǎng)基中添加10% 豬血清、30% 缺氧豬間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基。

15.根據(jù)權利要求1、12、13、14任一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，

所述的缺氧豬間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基是采用豬骨髓來源間充質(zhì)干細胞，使用Ham'sF10培養(yǎng)基，在37℃，1% -10%O₂，缺氧培養(yǎng)24-48小時收集的上清液，缺氧培養(yǎng)48小時。

16.根據(jù)權利要求15所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，

每皿加入8-15mL Ham's F10培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集其上清，過濾即得。

17.根據(jù)權利要求15所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，

所述的缺氧豬間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基用A-MEM培養(yǎng)基中添加10% -20%豬血清，在貼壁培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng)至少至第3-5代，當細胞生長匯合度達到90%以上后，棄上清液，用生理鹽水洗滌細胞至少2-3次；使用Ham's F10培養(yǎng)基，在37℃，1% -10%O₂缺氧培養(yǎng)24-48小時收集的上清液，0.22μm過濾器過濾即得。