[發明專利]一種高效生產戊二酸的重組大腸桿菌及其構建方法

有效

• 申請號: 202011191668.0
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112226398B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 劉立明;王鎵萍;丁爽;高聰;陳修來;劉佳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明通過分子生物學手段從大腸桿菌Escherichia coli MG1655基因組中克隆獲得賴氨酸脫羧酶基因cadA、丁二胺轉氨酶基因patA以及γ?氨基丁醛脫氫酶基因patD，從熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens基因組中克隆獲得4?氨基丁酸轉氨酶基因gabT和琥珀酸半醛脫氫酶基因gabD。將構建好的重組表達載體pETM6R1?cadA?RBS01?patA?RBS02?patD?gabT?gabD導入大腸桿菌E.coli W3110后，通過氨芐青霉素抗性平板篩選獲得高效生產戊二酸的重組菌株Glu?02。該重組菌株在5?L發酵罐下采用補料分批發酵策略，發酵60h，戊二酸產量達到56.2g/L，轉化率為62.2％。

技術領域

本發明涉及一種高效生產戊二酸的重組大腸桿菌及其構建方法，屬于代謝工程技術領域。

背景技術

戊二酸(Glutarate)，俗名膠酸，是一種脂肪族二元羧酸，分子式是C₅H₈O₄，分子量132.11，常溫下為無色針狀結晶固體，易溶于水、乙醇、乙醚等，在水中溶解度可達430g/L。在所有二元羧酸中，戊二酸的熔點最低，為95-98℃，這一良好的特性使其更適合用于尼龍-4,5和尼龍-5,5等聚酯和聚酰胺的生產。此外，戊二酸也是1,5-戊二醇的前體，1,5-戊二醇是用作助焊劑、活化劑以及重要藥物中間體的常用增塑劑。總之，戊二酸作為一種重要的C5平臺化合物，在藥物和化工合成等領域均具有重要的應用價值和發展潛力。

目前，戊二酸的主要合成方式是化學合成法，其中工業生產主要是在硝酸催化下從氧化環己酮和環己醇的混合物中回收利用，在實驗室水平也可完成較少劑量的制備工作，比如可分別以γ-丁內酯、二氫吡喃、戊二腈、環己酮等作為底物，通過一系列化學反應制備而得。然而通過傳統化學法合成戊二酸具有成本高、污染嚴重、操作條件要求高等缺點，因此尋找相對環保的生物法合成戊二酸對環境保護和高效生產以及未來戊二酸的生產前景都具有深遠的意義。

近年來，國內外研究人員從生化工程和代謝工程兩個方面對微生物生產戊二酸進行了探索研究。到目前為止，文獻報道過的戊二酸的生物合成途徑有以下四種，分別是：戊烯二酸還原途徑、碳鏈延長與脫羧途徑、反己二酸降解途徑以及賴氨酸降解途徑(包括以戊二胺為中間體的降解途徑和以5-氨基戊酸為中間體的降解途徑)。其中，賴氨酸降解途徑的理論產率最高，達到0.75mol/mol葡萄糖。尤其是以戊二胺為中間體的賴氨酸降解途徑由于不需要額外的氧氣供應，具有更大的改造和生產潛力。進一步提高戊二酸產量成為亟待解決的問題，同時也是當前世界各國科研人員關注的焦點之一。

發明內容

為解決上述問題，本發明的目的是提供一株高產戊二酸的大腸桿菌工程菌，以及應用該工程菌生產戊二酸的方法。本發明通過在大腸桿菌細胞中過量表達合成戊二酸的路徑酶賴氨酸脫羧酶、丁二胺轉氨酶、γ-氨基丁醛脫氫酶、4-氨基丁酸轉氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶，隨后通過改變RBS的強度精細化調控關鍵路徑酶丁二胺轉氨酶和γ-氨基丁醛脫氫酶的表達水平，進而實現了戊二酸的高效生產，為戊二酸的工業化生產奠定了基礎。

本發明的第一個目的是提供一種高效生產戊二酸的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌是在大腸桿菌宿主菌中過表達了賴氨酸脫羧酶cadA、丁二胺轉氨酶patA、γ-氨基丁醛脫氫酶patD、4-氨基丁酸轉氨酶gabT和琥珀酸半醛脫氫酶gabD；所述丁二胺轉氨酶通過核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的核糖體結合位點與表達載體相連。

進一步地，所述賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；丁二胺轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；γ-氨基丁醛脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；4-氨基丁酸轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。

進一步地，所述γ-氨基丁醛脫氫酶是通過核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核糖體結合位點與表達載體相連。