[發明專利]一種水稻核雄性不育保持系的回交轉育方法

有效

• 申請號: 202011187728.1
• 申請日: 2020-10-29
• 公開（公告）號: CN112352673B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 李燕群;李佳林;龍湍;羅凡;劉功鵬;曾翔;吳永忠
• 申請（專利權）人: 海南波蓮水稻基因科技有限公司
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張璐

1.一種水稻核雄性不育保持系的回交轉育方法，其特征在于，包括：

（1）以性狀優良、基因型為aaTt且含有完整載體元件的核雄性不育中間保持系為母本，以性狀優良、基因型為AAtt或Aatt的株系作為輪回親本，雜交后獲得F1代種子；

所述的載體元件包括育性恢復元件、花粉致死元件和篩選標記元件；

所述篩選標記元件包括熒光蛋白元件、苯達松敏感元件和雙草醚抗性元件；

選擇基因型為aaTt、熒光種子與非熒光種子比例為1:1、不育與可育花粉比例為1:1、苯達松敏感、抗雙草醚、綜合農藝性狀優良的核雄性不育中間保持系作為母本；

所述輪回親本為基因型為Aatt的核雄性不育雜合株系、基因型為AAtt的三系保持系、基因型為AAtt的兩系不育系或基因型為AAtt的具有不育系特征特性的常規稻；

（2）對F1代至BC_n-1F1代植株進行篩選，保留基因型為AaTt的F1代至BCn-1F1代植株為母本，繼續與輪回親本回交，經過多輪回交，篩選得到基因型為AaTt的BCnF1代種子；

所述篩選包括選擇抗雙草醚、苯達松敏感、基因型為AaTt、表型與輪回親本相似且可育與不育花粉比例為1：1的單株作為母本；

（3）種植所述BCnF1代種子，經過一輪或多輪自交，篩選得到性狀優良、表型穩定、基因型為aaTt的核雄性不育保持系；

其中，A代表核雄性不育位點野生型等位基因，a代表核雄性不育等位基因；T代表含有載體元件，t代表不含有載體元件。

2.根據權利要求1所述的回交轉育方法，其特征在于，步驟（1）中，先對核雄性不育中間保持系進行篩選后，再作為母本與輪回親本雜交；

其中，所述篩選包括：

①種子階段：對完熟的核雄性不育中間保持系每一單株均隨機挑選部分干種子進行熒光色選，剩余種子備用；淘汰熒光種子發光不明顯單株種子，播種熒光種子發光明顯且熒光種子與非熒光種子比例1:1的單株的熒光種子和備用種子；

②秧苗階段：

熒光種子的秧苗于3-4葉期，用含有苯達松或相似化學作用成分的除草劑作為篩選劑進行噴施，驗證了苯達松敏感元件在轉基因植株中是否正常工作；

備用種子秧苗于2-3葉期，以含有雙草醚的除草劑或相似化學作用成分的物質作為篩選劑進行噴施，篩選得到存活的轉基因植株，將存活的備用種子秧苗進行移栽；

③孕穗階段：挑選株高偏矮-中、株型緊湊、劍葉直立、分蘗中-多、莖稈壯和/或韌性好的優異單株取葉片，提DNA，利用PCR進行載體元件鑒定，保留各元件均存在單株繼續下一步試驗；

④抽穗階段：對孕穗階段經PCR檢測確定各元件均存在單株繼續進行表型選擇，挑選柱頭外露高、包頸較輕單株取成熟穎花，進行花粉碘染，保留不育花粉與可育花粉比例為1:1單株備用。

3.根據權利要求1~2中任一項所述的回交轉育方法，其特征在于，在步驟（2）~（3）中，所述篩選包括：前景選擇和表型選擇；

其中，所述前景選擇的目標基因包括：A-核雄性不育位點野生型等位基因、a-核雄性不育等位基因和T-含有所有載體元件。

4.根據權利要求3所述的回交轉育方法，其特征在于，在步驟（2）~（3）中，所述篩選還包括背景選擇。

5.根據權利要求3所述的回交轉育方法，其特征在于，在步驟（2）~（3）中，所述篩選包括：

種子階段：對每一單株均隨機挑選若干粒干種子進行熒光色選，剩余種子備用；淘汰熒光種子發光不明顯單株種子，播種熒光種子發光明顯且熒光種子與非熒光種子比例符合1:1的種子；

秧苗階段：秧苗于2-3葉期進行雙草醚噴施實驗，殺死非轉基因植株，并移栽；

秧苗-孕穗階段：秧苗期全部植株或孕穗期挑選部分綜合農藝性狀與輪回親本相似的單株，取葉片提DNA，利用PCR進行載體元件鑒定，保留各元件均存在的單株；

抽穗階段：選擇經秧苗階段和孕穗階段篩選保留下的單株取成熟穎花，進行花粉碘染，保留不育花粉與可育花粉比例符合1:1的單株備用。