[發明專利]一種高效三聯檢測中華鱉三種病原的LAMP引物及試劑盒

有效

• 申請號: 202011186685.5
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112210624B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 劉莉;樓寶;郭琦;沈衛鋒;韓明明;盧先東
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院;寧波愛基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6837;C12N15/11;C12R1/085
• 代理公司: 杭州知見專利代理有限公司 33295
• 代理人: 趙越劍

本發明公開了一種高效三聯檢測中華鱉三種病原的LAMP引物及試劑盒，包括微流控芯片檢測用反應體系，所述微流控芯片檢測用反應體系包括檢測TSHSV的引物、檢測TSFV的引物、檢測SYJ15的引物，以及反應液；檢測TSHSV的引物、檢測TSFV的引物、檢測SYJ15的引物分別預埋于微流控芯片上。本發明可以快速、準確的同時檢測TSHSV，TSFV和SYJ15。

技術領域

本發明涉及病原菌檢測技術領域，特別涉及一種高效三聯檢測中華鱉三種病原的LAMP引物及試劑盒。

背景技術

中華鱉(Trionyx?sinensis)俗稱甲魚、水魚或團魚，分類學上隸屬爬行綱(Reprilia)、龜鱉目(Chelonia)、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Triomx))，主要分布于中國、俄羅斯、日本、越南及其他東南亞等國家和地區，多棲息于江河、湖泊、塘、水庫等水流平緩、魚蝦繁生的淡水水域。我國鱉病的研究起步相對較晚，上世紀80年代初期幾乎沒有開展相關的研究工作。隨著集約化養鱉的迅速發展，鱉病的發生率和死亡率迅速上升，對養殖業造成巨大沖擊，鱉病及其治療的相關研究工作相繼開展。中華鱉病具有易受環境因素影響、潛伏期長、病程長、繼發感染普遍、并發癥多和治愈困難等特點，其發病原因是致病病原、環境條件、中華鱉本身三者之間相互作用的結果。迄今，已經報道的中華鱉疾病有30多種，有腐皮病、紅脖子病、紅底板病、疥瘡癥、中華鱉腮腺炎病、中華鱉出血病、白斑病、水霉病、鐘形蟲病，錐形蟲病、氨中毒癥、脂肪代謝不良等。申請人近幾年的研究表明，目前對中華鱉養殖危害最大的主要有中華鱉鰓腺炎(又包括病毒性和細菌性鰓腺炎)和中華鱉黃病毒病，相應的3種病原分別為病毒TSHSV(病毒性鰓腺炎病原)，中華鱉高致病性蠟樣芽孢桿菌SYJ15(細菌性鰓腺炎病原)和TSFV(中華鱉黃病毒病病原)。建立3種病原的快速分子診斷檢測技術，是中華鱉主要病害防控的重要技術支撐。目前病原分子診斷采用的技術主要是PCR技術，但由于其反應要在2個不同的溫度區循環，對儀器要求高，成本也相對高昂，并且PCR技術僅1對擴增引物，易受干擾，特異性相對不足，且出結果時間較久，操作專業要求高，微量加量步驟多。并且多種致病因逐一檢測，耗時久，操作繁瑣，且浪費試劑。近年來發展起來的LAMP技術共有4條不同的特異性引物，故而檢測結果準確度更高，但是由于是恒溫反應，缺少類似PCR的熱啟動酶，在設備升溫階段容易產生非特異性擴增從而影響檢測結果。

微流控芯片技術是通過生物學、化學、醫學、電子、材料、機械等多學科交叉，將分子生物學、化學分析、醫學等領域所涉及的樣品前處理、分離及檢測等過程集成到幾平方厘米的芯片上，從而實現分析的微型化、自動化、集成化和便攜化的技術，具有樣品消耗少、檢測速度快、操作簡便、多功能集成、體積小和便于攜帶等優點，已在多個領域得到應用。此外，因其體積小巧、操作簡單，極大地拓展了體外診斷的應用空間。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效三聯檢測中華鱉三種病原的LAMP引物及試劑盒。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種高效三聯檢測中華鱉三種病原的LAMP引物，包括檢測TSHSV的引物、檢測TSFV的引物和檢測SYJ15的引物；

檢測TSHSV的引物包括：

外引物

TSHSV-F3：5’-ACCACACCTAAACTTAAACCT-3’(SEQ?ID?No.1)；

TSHSV-B3：5’-GAATCCTTTATTGGGCCTTAC-3’(SEQ?ID?No.2)；

內引物

TSHSV-FIP：5’-CCTTTTCGCGGAACTGAGGGGTACTTGGACTTTGAATTCGC-3’(SEQ?IDNo.3)；

TSHSV-BIP：5’-TTGCAGGAATGTTCCAGTGTACTCAAATTGGGCTGGTTGT-3’(SEQ?IDNo.4)；