[發(fā)明專利]一種氫氧化鋁佐劑吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011185734.3
• 申請日: 2020-10-29
• 公開（公告）號: CN112316126B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊曉明;楊柏峰;周以斯;王麗;陳雯;方習(xí)靜;朱德武;李新國;段凱
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司
• 主分類號: A61K39/10
• 分類號: A61K39/10;A61K39/39;A61K47/02;A61P31/04
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明涉及一種氫氧化鋁佐劑吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制備方法，所述方法包括如下步驟：首先加入氫氧化鋁溶液，再加入一定量的0.85％的氯化鈉溶液，在攪拌條件下，加入PB溶液(200mmol/L)，攪拌使充分反應(yīng)1小時，然后按成品中抗原終濃度為10μg/mL加入Fim原液，充分?jǐn)嚢韬蟠姿峄驓溲趸c調(diào)節(jié)步驟(2)中溶液pH值至6.8?7.0，使氫氧化鋁與Fim蛋白充分吸附，向步驟(3)中溶液補(bǔ)加0.85％的氯化鈉溶液至100mL，混勻后制成氫氧化鋁?Fim抗原復(fù)合物制品，密封4℃保存。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種氫氧化鋁佐劑吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制備方法。

背景技術(shù)

博得特氏百日咳桿菌(Bordetella pertussis)是引起嬰兒呼吸道疾病的一種烈性傳染病病原體，世界范圍內(nèi)許多國家因接種百日咳疫苗使該疾病的死亡率和發(fā)病率大大降低。近幾年，在疫苗接種率達(dá)到85％以上的發(fā)達(dá)國家，出現(xiàn)了因百日咳死亡和發(fā)病率升高的現(xiàn)象，尤其是在年齡較大的兒童和青少年中該病例仍在增加，并作為傳播者向年齡太小而未接種疫苗的嬰兒傳播，間接證明了當(dāng)前主流疫苗的一些不足。百白破疫苗在嬰幼兒中長期廣泛地應(yīng)用改變了百日咳疾病的流行模式，即完成免疫程序的嬰幼兒可獲得免疫保護(hù)，由于沒有相應(yīng)的免疫措施致使青少年和成人的免疫保護(hù)力迅速衰減。然而這部分人群的感染，導(dǎo)致其成為嬰幼兒感染的主要傳染源。另外，盡管百日咳抗體能有效地通過母體胎盤傳遞給胎兒，但由于母體抗體水平過低且嬰兒血清抗體迅速下降，使得新生兒得不到足夠的保護(hù)。目前，呼吁對青少年進(jìn)行加強(qiáng)免疫及在孕期接種成人百日咳疫苗是最具成本效益的方法。

目前已上市的百日咳疫苗主要抗原是百日咳毒素(pertussis toxin，PT)和百日咳絲狀血凝素(filamentous hemagglutmin，F(xiàn)HA)，部分含有百日咳黏附素(pertactin，PRN)和百日咳菌毛蛋白(fimbriae，F(xiàn)im)。百日咳菌毛蛋白是一類具有粘附功能的細(xì)胞外膜蛋白，有Fim2和Fim3兩種血清型。近期兩個不同百日咳疫苗的臨床試驗(來自瑞士和德國的臨床試驗)，通過ELISA檢測抗Fim抗體水平在5-8EU/mL以上顯示出與感染百日咳風(fēng)險的降低呈現(xiàn)一定相關(guān)性，因此在無細(xì)胞百日咳疫苗中增加Fim抗原具有一定的現(xiàn)實意義。

為了增強(qiáng)疫苗的免疫效果，通用方法是在疫苗配方中加入鋁佐劑。目前已上市的百日咳疫苗都用含鋁佐劑(氫氧化鋁、磷酸鋁)吸附百日咳抗原。經(jīng)大量研究證實，設(shè)計含鋁佐劑疫苗需考慮的關(guān)鍵因素在于抗原與鋁佐劑的吸附方式和吸附效率。通常認(rèn)為，靜電吸引、疏水吸引和配基交換是鋁佐劑吸附抗原的主要吸附方式，其中靜電吸引最為常見。因蛋白質(zhì)易發(fā)生折疊，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化，減少了蛋白疏水區(qū)域?qū)λh(huán)境的暴露，因此限制了由疏水作用而產(chǎn)生的吸附；配基交換是氫氧化鋁表面的羥基被抗原表面的磷酸基團(tuán)所取代，這種吸附方式作用力最強(qiáng)。疫苗的免疫效果與佐劑對抗原的吸附率密切相關(guān)，而疫苗中磷酸根和氯化鈉濃度等因素會影響著佐劑對抗原的吸附強(qiáng)度。湛琳麗的實驗和Gupta等在小鼠中已經(jīng)證實影響抗原免疫原性的最重要因素之一是佐劑對抗原的吸附率。吸附率越高，免疫效果越好；反之，免疫效果越差。田俊楠等在鋁佐劑重組戊型肝炎疫苗中發(fā)現(xiàn)，隨著疫苗中磷酸根含量的增加，鋁佐劑對抗原的最大吸附量逐漸降低，而免疫小鼠后誘導(dǎo)的抗體滴度反而逐漸增高，表明在一定范圍內(nèi)增加磷酸根離子的濃度可降低鋁佐劑對抗原的吸附強(qiáng)度，但提高了疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)的目的在于提供一種氫氧化鋁佐劑吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(1)用注射用水分別配制200mmol/L的磷酸/磷酸鹽緩沖液(Phosphere BufferedSaline，PBS)溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的氯化鈉溶液、5％醋酸和0.1mol/L氫氧化鈉溶液，所有溶液經(jīng)0.22μm濾膜除菌過濾，保存待用；