[發明專利]熱穩定性提高的胰蛋白酶突變體

有效

• 申請號: 202011184570.2
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112280770B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 劉松;彭文堅;陳堅;周景文
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了熱穩定性提高的胰蛋白酶突變體，屬于基因工程技術領域。本發明在高酶活灰色鏈霉菌胰蛋白酶基礎上，通過定點突變生物技術改造胰蛋白酶分子結構，分析了SGT所有精氨酸與賴氨酸位點對酶熱穩定性的影響，并通過半理性設計最終獲得三株熱穩定性調高的突變菌株K68T，R146L，R225L。三株突變體在熱穩定顯著提高同時酶的活性不受影響并提高了酶活。這些突變體能夠在較高溫度下進行工業生產，利于生產工藝的靈活性，具有良好的工業應用前景。

技術領域

本發明涉及熱穩定性提高的胰蛋白酶突變體，屬于基因工程技術領域。

背景技術

胰蛋白酶作為一種多肽水解酶能夠專一性地切割肽鏈中精氨酸或賴氨酸的羧基端。其在許多領域有廣泛的應用。可以應用在皮革加工中局部皮革處理及脫灰軟化：清除裸皮中的皮垢清除，纖維基質，從而增強皮革的豐滿柔軟度、彈性、粒面光滑度；在醫藥可以應用在創面凈化、促進肉芽組織新生、抗炎癥等；在食品工業中應用于特異性水解膠原蛋白等天然蛋白，制備功能性多肽；此外胰蛋白酶還是多肽質譜、蛋白組學分析的重要工具酶。

動物來源的胰蛋白酶對人體有潛在的免疫原性，因此，因此異源表達與牛胰蛋白酶同源性高的微生物來源灰色鏈霉菌胰蛋白酶(SGT)具有重要的應用價值。與常用的商品化豬源胰蛋白酶和牛源胰蛋白酶相比，SGT具有更顯著的切割效率，產生大量胰酶特異性切割的多肽序列。但是，由于SGT高效的水解活性，其在異源分泌表達過程中產生自降解問題。

但目前對于SGT異源分泌表達過程中穩定性差從而產生自降解問題，還沒有很好的解決方案。如果能夠提升SGT在異源表達中的穩定性，將能顯著提高該酶的生產應用價值，更有助于工業化生產。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了熱穩定性提高的胰蛋白酶突變體，以及能夠表達所述胰蛋白酶突變體的畢赤酵母工程菌。

前期研究工作中，發明人已獲得一種高酶活的胰蛋白酶重組畢赤酵母工程菌，該酵母菌表達氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶，SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明在親本氨基酸的基礎上對其進行了適當的突變，從而獲得了穩定性、酶活提高的突變體，為胰蛋白酶在產業上的應用提供了廣闊的前景。

本發明提供了胰蛋白酶突變體，所述突變體以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰蛋白酶為親本，分別將其第68位、146位或225位的氨基酸進行突變。

在本發明的一種實施方式中，所述胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，分別將親本第68位氨基酸突變為蘇氨酸、第146位氨基酸突變為亮氨酸、或225位的氨基酸突變為亮氨酸。

在本發明的一種實施方式中，將親本第68位的賴氨酸突變位丙氨酸(K68T)；或將親本第146位的精氨酸突變為亮氨酸(R146L)；或將225位的精氨酸突變為丙氨酸(R225L)。

本發明提供了編碼所述突變體的基因。

本發明提供了攜帶權利要求3所述基因的載體。

在本發明的一種實施方式中，所述載體為pPIc9k、pHIL-S1、pPIcza、pYAM75P6中的任意一種。

本發明提供了表達所述突變體，或含有所述基因的宿主細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115、KM71、KM71H和/或X33。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物細胞為原核細胞或真核細胞。

本發明提供了一種制備權利要求1所述突變體的方法，其特征在于，步驟如下：