[發(fā)明專利]一種可提高番茄中輔酶Q10

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011182841.0
• 申請日: 2020-10-29
• 公開（公告）號: CN112280797B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發(fā)明（設計）人: 許晶晶;范航;陳曉亞;楊蕾
• 申請（專利權）人: 上海辰山植物園
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

1.一種可提高番茄中輔酶Q₁₀含量的聯(lián)合載體構建方法，其特征在于，步驟包括：

S1、提取番茄基因組DNA，通過PCR擴增獲得E8啟動子序列；通過全合成獲得煙草Coq2基因編碼序列，如SEQ ID NO.1所示；提取煙草基因組RNA，通過反轉錄獲得cDNA，再通過PCR擴增獲得DPS基因編碼序列，如SEQ ID NO.2所示；通過全合成獲得擬南芥HMGR2基因編碼序列，如SEQ ID NO.3所示；通過全合成獲得N端融合了番茄葉綠體信號肽的大腸桿菌UbiC基因編碼序列，如SEQ ID NO.4所示；提取擬南芥基因組DNA，通過PCR擴增獲得hsp終止子序列；

S2、通過Golden Gate克隆法將所述E8啟動子序列連入載體pUAP1，以獲得E8啟動子的level 0載體；通過Golden Gate克隆法將所述Coq2基因編碼序列連入另一載體pUAP1，以獲得Coq2基因的level 0載體；通過Golden Gate克隆法將所述DPS基因編碼序列連入另一載體pUAP1，以獲得DPS基因的level 0載體；通過Golden Gate克隆法將所述HMGR2基因編碼序列連入另一載體pUAP1，以獲得HMGR2基因的level 0載體；通過Golden Gate克隆法將所述UbiC基因編碼序列連入另一載體pUAP1，以獲得UbiC基因的level 0載體；通過Golden Gate克隆法將所述hsp終止子序列連入另一載體pUAP1，以獲得hsp終止子的level 0載體；

S3、通過Golden Gate克隆法將所述E8啟動子序列、所述Coq2基因編碼序列和所述hsp終止子序列依次連入載體pICH47742，以獲得Coq2基因的level 1載體；通過Golden Gate克隆法將所述E8啟動子序列、所述DPS基因編碼序列和所述hsp終止子序列依次連入載體pICH47751，以獲得DPS基因的level 1載體；通過Golden Gate克隆法將所述E8啟動子序列、所述HMGR2基因編碼序列和所述hsp終止子序列依次連入載體pICH47761，以獲得HMGR2基因的level 1載體；通過Golden Gate克隆法將所述E8啟動子序列、所述UbiC基因編碼序列和所述hsp終止子序列依次連入載體pICH47772，以獲得UbiC基因的level 1載體；

S4、通過Golden Gate克隆法將35S啟動子序列、潮霉素抗性基因編碼序列和35S終止子序列，所述E8啟動子序列、所述Coq2基因編碼序列和所述hsp終止子序列，所述E8啟動子序列、所述DPS基因編碼序列和所述hsp終止子序列，所述E8啟動子序列、所述HMGR2基因編碼序列和所述hsp終止子序列，所述E8啟動子序列、所述UbiC基因編碼序列和所述hsp終止子序列依次連入載體pICSL4723-P1，所獲得的level 2載體即為所述聯(lián)合載體，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合載體構建方法，其特征在于，步驟S1中各所述的PCR擴增體系均為：模板，即500ng所述基因組DNA或50ng所述cDNA；0.2μM正向引物；0.2μM反向引物；10μL Fastpfu緩沖液；0.2mM dNTPs；2.5units Fastpfu DNA聚合酶；H₂O補足至50μL；

PCR擴增程序均為：95℃，2min；95℃，20s、58℃，20s、72℃，2min，循環(huán)33次；72℃，5min。

3.根據(jù)權利要求2所述的聯(lián)合載體構建方法，其特征在于，番茄基因組DNA的PCR擴增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；煙草cDNA的PCR擴增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；擬南芥基因組DNA的PCR擴增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

4.根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合載體構建方法，其特征在于，通過所述全合成獲得相應基因編碼序列時，修改其中部分的堿基以去除BsaI和BpiI酶切位點。