[發明專利]一種CRISPR/Cas9基因載體、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 202011178718.1
• 申請日: 2020-10-29
• 公開（公告）號: CN112251440A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 馬昆;李文哲;朱光;池浩;尹雅琳;許建強;郭兆明;王黎;崔昌浩
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/87;C08G81/00
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 李曉亮

本發明提供了一種CRISPR/Cas9基因載體、其制備方法及應用，其中所述的CRISPR/Cas9基因載體，其是一種表面經修飾的聚多巴胺納米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亞胺、地塞米松和透明質酸，其中，聚多巴胺表面修飾有聚乙烯亞胺、地塞米松和透明質酸，地塞米松通過π?π共軛負載至聚多巴胺表面，聚乙烯亞胺修飾于聚多巴胺表面，透明質酸通過靜電吸附作用在聚多巴胺表面。該CRISPR/Cas9基因載體傳遞效率高、毒性低，生物安全性好，并且制備方法簡單，條件溫和，擁有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，提供了一種CRISPR/Cas9基因載體、其制備方法及應用。

技術背景

人類許多重大疾病的發生均與基因缺陷有關，包括絕大部分遺傳病、鐮刀型細胞貧血癥、糖尿病、腫瘤等。目前傳統化療或手術治療仍然不能有效治愈這些重大疾病，基因治療被認為是治療這些重大疾病的有效手段。CRISPR/Cas9基因編輯技術因高效靶向性、操作簡便的優勢，成為治療基因疾病的研究熱點。

常用的基因載體有兩類：病毒載體與非病毒載體。目前CRISPR/Cas9系統的傳遞多采用慢病毒載體以提高基因的轉染效率，從而確保CRISPR/Cas9系統實現其基因編輯的目的。但是慢病毒載體傾向于插入宿主基因組的高表達區域，有較強的致癌、致突變性，目前已經停止臨床應用。同時病毒載體的靶向性不強，制備過程復雜，成本較高等缺陷也限制了其臨床應用。非病毒載體的生物安全性與靶向性較高，但是沒有基因組整合能力，轉染效率較低，表達時效短，無法滿足CRISPR/Cas9系統傳遞的需要。

本發明制備一種新型非病毒基因載體，該載體能將CRISPR/Cas9基因靶向傳遞至腫瘤細胞，再靶向傳遞至細胞核，并通過轉座子將CRISPR/Cas9基因整合至宿主基因組，實現對目的基因的高效敲除。首先，將CRISPR/Cas9基因克隆至“睡美人”轉座子中得到pT2SpCas9重組質粒，然后設計靶向特定基因(如：Nanog基因)的sgRNA并插入pT2SpCas9中得到pT2SpCas9-nanog重組質粒。利用睡美人轉座子的轉座能力，提高將目的基因插入宿主基因組的整合效率，尤其是對于難以轉染的祖細胞、干細胞、生殖細胞等，使轉基因表達可以穩定的遺傳到子代，提高CRISPR/Cas9系統的基因編輯效率。為了將pT2SpCas9基因靶向遞送至細胞，本發明制備聚多巴胺(Polydopamine，PDA)納米粒，在其表面修飾聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)。將地塞米松(Dexamethasone，DEX)通過π-π共軛負載至PDA表面，使載體具有細胞核靶向能力。最后通過靜電吸附作用將透明質酸(Hyaluronic acid，HA)修飾在PDA表面，使載體具有腫瘤細胞靶向性，得到PDA/DEX-PEI@HA(PDPH)基因載體。該基因載體具有極低的細胞毒性和較高的轉染效率，可以將pT2SpCas9重組質粒靶向傳遞至腫瘤細胞，并靶向傳遞至細胞核，再將CRISPR/Cas9基因插入細胞基因組中，對靶細胞進行高效的基因編輯。PDPH的生物安全性和轉染效率遠高于其他傳統基因載體，是優秀的CRISPR/Cas9基因傳遞載體。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠高效傳遞CRISPR/Cas9系統的基因載體、其制備方法及應用，該基因載體可以將CRISPR/Cas9系統靶向傳遞至目的細胞，并傳遞至細胞核，再利用轉座子將CRISPR/Cas9系統插入宿主基因組，提高其基因編輯的效率。該基因載體傳遞效率高、毒性低，生物安全性好，并且制備方法簡單，條件溫和，擁有廣闊的應用前景。

第一方面，本發明提供了一種CRISPR/Cas9基因載體，其是一種表面經修飾的聚多巴胺納米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亞胺、地塞米松和透明質酸，其中，聚多巴胺表面修飾有聚乙烯亞胺、地塞米松和透明質酸，地塞米松通過π-π共軛負載至聚多巴胺表面，聚乙烯亞胺修飾于聚多巴胺表面，透明質酸通過靜電吸附作用在聚多巴胺表面。其中，聚多巴胺、聚乙烯亞胺、地塞米松和透明質酸的質量比為5：(2.5-3)：(6-7)：(5-10)。