[發(fā)明專利]一種細(xì)胞殺傷效力的評(píng)價(jià)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011173508.3
• 申請(qǐng)日: 2020-10-28
• 公開（公告）號(hào): CN112285083B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅浦文;姜晶;陳凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海睿鈺生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供一種細(xì)胞殺傷效力的評(píng)價(jià)方法。所述評(píng)價(jià)方法包括如下步驟：(1)將攜帶熒光標(biāo)記A的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，再使用熒光標(biāo)記B對(duì)共培養(yǎng)后產(chǎn)生的死細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，其中，熒光標(biāo)記A與熒光標(biāo)記B對(duì)應(yīng)的激發(fā)光波長(zhǎng)不同；(2)分別使用明場(chǎng)、熒光標(biāo)記A匹配的熒光通道和熒光標(biāo)記B匹配的熒光通道對(duì)染色標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行顯微成像，得到顯微圖像；(3)對(duì)所得到的顯微圖像進(jìn)行疊加合成分析，根據(jù)分析結(jié)果評(píng)估所述效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞殺傷效力。本發(fā)明中，用熒光試劑A和熒光標(biāo)記B分別對(duì)靶細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，而后熒光顯微成像和圖像合成分析，能夠快速、直觀且準(zhǔn)確地得到細(xì)胞殺傷效力的評(píng)價(jià)結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞殺傷效力的評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)

與目前的生物制品相比，免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品具有其獨(dú)特的特性，如起始個(gè)體差異大、制備工藝規(guī)模化程度低、制劑多為活細(xì)胞產(chǎn)品、作用機(jī)制不是很明確等，使得這類產(chǎn)品的一致性差、批量有限、效期短、同一類產(chǎn)品的可比性差等，這些特點(diǎn)均大大增加了質(zhì)量控制研究的難度，其中殺傷效力質(zhì)量控制便是難點(diǎn)之一。同時(shí)，在進(jìn)行病人的免疫水平評(píng)價(jià)，腫瘤治療愈后評(píng)價(jià)，以及細(xì)胞治療過(guò)程中的免疫細(xì)胞的增殖能力評(píng)價(jià)等環(huán)節(jié)中，也都需要對(duì)免疫細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)行評(píng)估。

常用的細(xì)胞殺傷檢測(cè)方法有鎘51釋放實(shí)驗(yàn)、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法、BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法等。其中經(jīng)典的方法是鎘51釋放實(shí)驗(yàn)，該方法可重復(fù)性好，但是，因其使用同位素標(biāo)記靶細(xì)胞，從而存在半衰期短、同位素廢棄物處理及實(shí)驗(yàn)防護(hù)要求高等多種限制因素，尤其是放射性同位素的使用對(duì)健康以及環(huán)境具有巨大威脅，其他放射性同位素標(biāo)記靶細(xì)胞如H3亦具有此類缺陷，使該類方法的應(yīng)用受到局限，因此，很多研究者會(huì)采用其它替代方法進(jìn)行生物學(xué)效力檢測(cè)。傳統(tǒng)的LDH法靈敏度及可重復(fù)性不穩(wěn)定，且所需時(shí)間較長(zhǎng)，批間變異較大，不能適應(yīng)免疫細(xì)胞效期短的特點(diǎn)。

鎘51釋放實(shí)驗(yàn)、LDH法、BATDA法和CytoTox-Glo法都屬于間接法，即先用某一試劑對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后和不同濃度的免疫細(xì)胞進(jìn)行孵育，當(dāng)靶細(xì)胞受到免疫細(xì)胞的攻擊而損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，這些物質(zhì)會(huì)釋放到上清中，通過(guò)測(cè)定釋放物質(zhì)的含量可以測(cè)定免疫細(xì)胞的活性。上述方法都是通過(guò)釋放物質(zhì)含量的測(cè)定而間接進(jìn)行定量，反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短、儀器檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)都會(huì)對(duì)讀取的數(shù)值造成影響。

CAM法及PKH法是通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞標(biāo)記及死亡標(biāo)記雙信號(hào)來(lái)反映其殺傷效率，與前述方法相比，這兩種方法所反映的信號(hào)還包括處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞。其中，流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是一種在液流系統(tǒng)中快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)。鑒于其在單細(xì)胞水平上高效準(zhǔn)確的定量分析優(yōu)勢(shì)，目前涌現(xiàn)出多種以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的NK細(xì)胞殺傷活性的測(cè)定方法，但仍然存在缺陷。

由于效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞在共培養(yǎng)過(guò)程中，靶細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生一定抑制和破壞作用，則共培養(yǎng)體系的死亡率可能是包括靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的共同死亡率。流式分析的方法實(shí)驗(yàn)階段需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)電壓，數(shù)據(jù)分析階段需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行圈門，這樣的過(guò)程引入了操作人和分析人的主觀誤差。因此，盡管流式細(xì)胞術(shù)能夠特異性地檢測(cè)靶細(xì)胞的凋亡率，流式細(xì)胞儀屬于液流系統(tǒng)，無(wú)法采集到細(xì)胞圖像，若需要驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要借助顯微鏡或其他儀器觀察進(jìn)行佐證。這導(dǎo)致流式的分析方法雖然在科研領(lǐng)域被廣泛的使用，但是在需要標(biāo)準(zhǔn)化可重復(fù)驗(yàn)證的醫(yī)療診斷和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域難以廣泛使用。

因此，開發(fā)一種基于顯微圖像識(shí)別的、直觀可視地、準(zhǔn)確地評(píng)估細(xì)胞殺傷效力的方法，對(duì)于免疫細(xì)胞制品的研發(fā)或免疫細(xì)胞療法及臨床免疫評(píng)價(jià)的發(fā)展具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞殺傷效力的評(píng)價(jià)方法及其應(yīng)用。所述評(píng)價(jià)方法先通過(guò)對(duì)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，區(qū)分活靶細(xì)胞、死靶細(xì)胞、活效應(yīng)細(xì)胞和死效應(yīng)細(xì)胞，并結(jié)合熒光顯微成像和圖像合成分析方法，根據(jù)對(duì)應(yīng)細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算得到細(xì)胞殺傷率。