[發明專利]齊整小核菌內源小核菌膠水解酶及應用

有效

• 申請號: 202011172161.0
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112266907B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 曾偉主;周景文;譚潤卿;陳堅;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/04;C12P19/14;A61K38/47;A61K8/66;A23L29/00;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了齊整小核菌內源小核菌膠水解酶及應用，屬于酶工程技術領域。本發明從齊整小核菌中挖掘出14個潛在的β?葡聚糖酶基因，在畢赤酵母中對潛在的水解酶基因進行異源表達并進行功能驗證，篩選獲得了對小核菌膠具有正向水解效果的小核菌膠水解酶及其編碼基因。該小核菌膠水解酶能夠在pH 6.0的條件下對小核菌膠進行水解，使數均分子量由2.748×10⁷Da降低至1.923×10⁷Da，克服小核菌膠三維結構的束縛直接對糖苷鍵進行切割。

技術領域

本發明涉及齊整小核菌內源小核菌膠水解酶及應用，屬于酶工程技術領域。

背景技術

小核菌膠(又稱硬葡聚糖，Scleroglucan)是一種非離子型的水溶性微生物胞外多糖，由β-D-1,3吡喃葡萄糖和β-D-1,6吡喃葡萄糖殘基交替連接而成，平均每3個β-1,3糖苷鍵連接的主鏈單元連接1個β-1,6糖苷鍵的側鏈。這種重復單元結構使小核菌膠分支度達0.33左右。小核菌膠除了具有大多數β-1,3葡聚糖共有的生物活性特征外，高分支化頻率使其具有高水溶性特點。由于獨特的化學結構和高分子量特性，小核菌膠具有良好的水溶性、假塑性、保濕性、耐鹽性和粘度穩定性，廣泛應用于食品、生物醫藥、石油化工和化妝品等行業。

目前，小核菌膠主要以微生物發酵的方式生產。齊整小核菌Sclerotium rolfsii是最主要的生產菌株，其可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和糖蜜等進行發酵生產。針對齊整小核菌生產小核菌膠的研究主要集中在提高小核菌膠產量和產率等方面。小菌核屬真菌發酵法生產的小核菌膠分子量較高，從而導致其溶解性、流動性、分散性較差，為其工業應用帶來困難。小核菌膠的活性通常與粘度及分子量密切有關，分子量過大時水溶性差，分子量過低則會使小核菌膠失去生理活性。如何選擇合適的降解方法對小核菌膠進行改性，獲得理想的分子量，在保持活性的基礎上提高其水溶性，從而擴大其工業應用是目前亟待解決的問題。

已有研究表明，將來源于環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜堿擬諾卡氏菌(Alkaliphilic nocardiopsis)的β-1,3葡聚糖酶基因BGLM、PGLA、EXG1和BGLF在大腸桿菌和畢赤酵母中的重組表達，經4個酶粗酶液處理過后對小核菌膠幾乎沒有水解作用。另外，小核菌膠在水中溶解會形成剛性的三重螺旋結構，側鏈的葡萄糖基均勻分布于螺旋結構的外側，通過靜電力作用防止螺旋聚集，這樣既可以穩定多糖結構，同時還能降低小核菌膠的膠凝能力。三重螺旋結構對熱非常穩定，只有當分散在二甲亞砜(DMSO)中或在pH值大于12.5時，小核菌膠才可溶解形成無規則卷曲的單鏈結構。小核菌膠的這種三維結構使糖苷連接鍵被包裹，大大影響了葡聚糖水解酶的結合和水解作用效率，前期研究發現，常規β-葡聚糖酶都不能起到水解小核菌膠從而改善其分子量的效果。因此，篩選具有小核菌膠降解能力的水解酶對于制備低分子量的小核菌膠具有重要的意義。

發明內容

本發明從保藏編號為CCTCC NO：M2017646的齊整小核菌WSH-G01中篩選獲得了具有小核菌膠水解能力的小核菌膠水解酶及編碼該酶的基因，為小分子量小核菌膠的大規模生產提供了研究基礎。

本發明的第一個目的是提供一種小核菌膠水解酶，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本發明的第二個目的是提供編碼所述小核菌膠水解酶的基因。

在一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明的第三個目的是提供攜帶所述基因的表達載體。

在一種實施方式中，所述表達載體為pPIC9K。

本發明的第四個目的是提供表達所述小核菌膠水解酶的重組微生物細胞。

在一種實施方式中，所述微生物為畢赤酵母。