[發明專利]用于產聚合物雙歧桿菌蛋白提取的提取劑及提取方法與應用

有效

• 申請號: 202011169856.3
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112430257B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 宋佳興;周曉光;李運濤;佟雪梅;宋合興
• 申請（專利權）人: 融智生物科技（青島）有限公司
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C07K1/14;C12Q1/04;G01N27/64;C12R1/01
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

本發明公開了一種用于產聚合物雙歧桿菌蛋白提取的提取劑及提取方法與應用。本發明的提取劑包括釋放液和無水乙醇，其中，所述釋放液為70％甲酸水溶液。本發明還提供了利用該提取劑進行產聚合物雙歧桿菌蛋白的提取方法。本發明開發的針對產聚合物雙歧桿菌的提取劑及提取方法可有效去除聚合物對提取蛋白的影響，并可依托于MALDI?TOF技術對雙歧桿菌進行快速鑒定。

技術領域

本發明涉及微生物檢測與鑒定技術領域。更具體地，涉及一種用于產聚合物雙歧桿菌蛋白提取的提取劑及提取方法與應用。

背景技術

雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)是一種革蘭氏陽性、不運動、細胞呈桿狀、一端有時呈分叉狀、嚴格厭氧的細菌屬，廣泛存在于人和動物的消化道、陰道和口腔等生境中。雙歧桿菌屬的細菌是人和動物腸道菌群的重要組成成員之一。一些雙歧桿菌的菌株可以作為益生菌而用在食品、醫藥和飼料方面。

通常對于雙歧桿菌的鑒定目前主要分為兩大類：

一類是形態與生理生化鑒定：X-Gal顯色劑可用于初步判定是否為雙歧桿菌，而革蘭氏染色是最常用的形態鑒定方法。對于在顯微鏡下形狀為Y型、V型或者短桿狀、棒狀的菌落可進行糖發酵試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽試驗、糖發酵試驗、F6PPK試驗、KOH試驗、過氧化氫酶試驗、需氧試驗、運動性檢測等生理生化鑒定試驗，通過這些試驗可以最終確定雙歧桿菌的種屬及類別。

另一類是分子生物學鑒定：糖發酵等生理生化試驗不能區分出性狀相近的菌種，而對于菌株水平的鑒定就更加困難，所以科學家們先后利用先進的單胞技術、DNA雜交技術、蛋白質電泳技術、免疫技術以及同工酶譜分析技術等分離出雙歧桿菌并探討了它的種間親緣關系，且已取得了一批有重要意義的成果。在這些技術的基礎上，經過人們的努力，已有了一些更加科學有效的方法，如核酸探針雜交技術、PCR技術、分子標記技術等。

但是從形態學以及生化反應方面對雙歧桿菌進行鑒定，通常耗時長，鑒定過程繁瑣冗長，而通過分子生物學方面對雙歧桿菌進行鑒定正在成為主流手段。近年來MALDI-TOF技術日漸成熟，對于細菌的鑒定越來越簡單便捷，通常一個細菌分純后只需要幾分鐘就可以得到鑒定結果，且結果可靠。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。

但是在使用MALDI-TOF對雙歧桿菌進行鑒定的過程中發現，某些雙歧桿菌在生長過程中會產生聚合物，例如胞外多糖，在基質與此類雙歧桿菌進行共結晶時會使得聚合物與蛋白同時被電離，采集結果中的聚合物峰對蛋白峰產生影響，在對比數據庫時會出現鑒定錯誤的情況，因此去除聚合物保留蛋白就成為鑒定此類雙歧桿菌的關鍵。

目前，尚未有專門針對產聚合物雙歧桿菌的適用于質譜鑒定的前處理試劑或方法。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種用于產聚合物雙歧桿菌蛋白提取的提取劑。

本發明的另一個目的在于提供一種產聚合物雙歧桿菌蛋白的提取方法。

本發明的第三個目的在于提供上述提取劑和提取方法的應用。

為達到上述目的，本發明采用下述技術方案：

第一方面，本發明提供了一種用于產聚合物雙歧桿菌蛋白提取的提取劑，該提取劑包括釋放液和無水乙醇，其中，所述釋放液為70％甲酸水溶液。在本發明中，％如無特別說明表示體積百分濃度。

本發明提供的提取劑能夠針對某些產聚合物雙歧桿菌，例如，長雙歧桿菌長亞種CGMCC1.5052，長雙歧桿菌長亞種CGMCC1.5082，長雙歧桿菌長亞種CGMCC1.5014等，有效去除聚合物，提取出蛋白，然后通過MALDI-TOF質譜技術采集蛋白譜圖，可實現在食品檢驗，醫療檢驗等方面對該類雙歧桿菌快速鑒定得到種屬信息。