[發(fā)明專利]一種消除背景差異的蘿卜與甘藍同源基因功能研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011168199.0
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112322650A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 張曉輝;張雙雙;王海平;李錫香;宋江萍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/20;C12Q1/6895
• 代理公司: 成都方圓聿聯(lián)專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 茍銘

1.一種消除背景差異的蘿卜與甘藍同源基因功能研究方法，其特征在于，該方法通過在蘿卜與甘藍遠緣雜種中進行轉(zhuǎn)基因或基因編輯，超表達或突變蘿卜和甘藍的同源基因，比較分析轉(zhuǎn)基因植株和突變體的表型，研究蘿卜和甘藍同源基因的功能及其功能分化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述蘿卜與甘藍遠緣雜種是利用蘿卜與甘藍遠緣雜交，雜種植株加倍成異源四倍體，多代自交后使遺傳穩(wěn)定和育性恢復。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的研究方法，其特征在于，所述蘿卜包括RR基因組的所有亞種、變種，所述甘藍包括CC基因組的所有亞種、變種，所述異源四倍體是指含有RRCC基因組的植株。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述蘿卜與甘藍遠緣雜種的遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述遺傳轉(zhuǎn)化步驟為：

無菌苗制備：選取飽滿的種子，清洗、消毒后均勻播種于播種培養(yǎng)基上，所述播種培養(yǎng)基組成為：1/2MS，蔗糖30g/L，瓊脂7.5g/L或植物凝膠2.5g/L，調(diào)節(jié)pH至5.8±0.1，高壓蒸汽滅菌；

預培養(yǎng)：選取苗齡6-10d的幼苗，當外植體用下胚軸時，切取下胚軸，在預培養(yǎng)培養(yǎng)基上鋪一張無菌濾紙，將下胚軸平放于濾紙上；當外植體用子葉盤時，切下子葉后平放于預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，封口膜將培養(yǎng)皿封好，預培養(yǎng)2-4d；所述預培養(yǎng)基組成為：MS+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L或植物凝膠2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，調(diào)節(jié)pH至5.8±0.1，高壓蒸汽滅菌后加AgNO₃至5mg/L；

搖菌：配置LB培養(yǎng)基，其中加入篩選抗生素和利福平，從平板上挑取含有目的基因超表達或敲除或編輯的載體的農(nóng)桿菌或直接加入新鮮菌液，震蕩培養(yǎng)過夜，震蕩條件：28℃，250r/min；

農(nóng)桿菌懸浮液配置：搖菌至OD600＝0.6-0.8，菌液倒入無菌離心管中，離心，棄上清后加入DM懸浮液，重懸后倒入無菌三角瓶，放入搖床中30min-1h，震蕩條件250r/min，28℃，之后，取出菌液，以加入乙酰丁香酮的DM懸浮液為背景，稀釋菌液至OD600＝0.5-0.6；所述DM懸浮液的制備方法為：MS+蔗糖30g/L，調(diào)節(jié)pH至5.8±0.1，高壓蒸汽滅菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮至100μmol/L；

共培養(yǎng)：將預培養(yǎng)2-4d的外植體置于OD600＝0.5-0.6的農(nóng)桿菌懸浮液中侵染，期間不斷搖晃，之后將外植體置于無菌濾紙上，將菌液吸干，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上鋪一張無菌濾紙，將下胚軸平放于濾紙上，子葉盤不需濾紙直接放于培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿封好后，共培養(yǎng)2-4d，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為：MS+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L或植物凝膠2.5g/L+2,4-D 1mg/L+KT 0.3mg/L，調(diào)節(jié)pH至5.8±0.1，高壓蒸汽滅菌后加入乙酰丁香酮至100μmol/L；

延遲培養(yǎng):將共培養(yǎng)2-4d的外植體轉(zhuǎn)移到延遲培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-4d，所述延遲培養(yǎng)基組成為：MS+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L或植物凝膠2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L,調(diào)節(jié)pH至5.8±0.1，高壓蒸汽滅菌后加入AgNO₃至5mg/L，加Tinmentin至200mg/L；

篩選培養(yǎng)：將延遲培養(yǎng)2-4d的外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)培養(yǎng)基上，光照強度為2000-4000lx,培養(yǎng)2-3周后開始出現(xiàn)芽分化，每培養(yǎng)20-30d轉(zhuǎn)到新的篩選培養(yǎng)基中，所述篩選培養(yǎng)基組成為：MS+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L或植物凝膠2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，調(diào)節(jié)pH至5.8±0.1，高壓蒸汽滅菌后加入AgNO₃、Timentin和潮霉素，分別至5mg/L、200mg/L和10mg/L；

生根培養(yǎng)：將發(fā)育完全的芽切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基組成為：MS+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L或植物凝膠2.5g/L+NAA 0.1mg/L,調(diào)節(jié)pH為5.8，高壓蒸汽滅菌后加入AgNO₃、Timentin和潮霉素，分別至5mg/L、200mg/L和5mg/L；

煉苗：將組培生根的轉(zhuǎn)基因苗取出，流水沖掉根部的培養(yǎng)基后移栽到蛭石中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為20h光照+4h黑暗，每天澆水保證濕度，3d后開始澆營養(yǎng)液，煉苗7d后移植到溫室中。