[發(fā)明專利]一種鑒定魚糜凝膠中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的交聯(lián)位點的分析方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011164128.3
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112359089B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尤娟;方夢雪;熊善柏;尹濤;胡楊;杜紅英;劉茹;劉友明
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/37;G01N27/62;G01N30/89
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11562
• 代理人: 王穎

本發(fā)明公開一種鑒定魚糜凝膠中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的交聯(lián)位點的分析方法，屬于食品檢測領(lǐng)域；具體為對數(shù)據(jù)結(jié)果在對應(yīng)的物種庫中進(jìn)行檢索，鑒定得到置信區(qū)間在95％以上的肽段序列，并在相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列上進(jìn)行標(biāo)記；將魚糜凝膠中未被鑒定到的賴氨酸與未發(fā)生交聯(lián)的生魚糜中未被鑒定到的賴氨酸進(jìn)行比較，額外增加的賴氨酸即為發(fā)生交聯(lián)的賴氨酸。此方法所需材料和方法簡單，無需任何標(biāo)記即可鑒定出參與G?L異肽鍵交聯(lián)的賴氨酸的位點，對于研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)交聯(lián)的魚糜凝膠提供了理論基礎(chǔ)，為開發(fā)更健康的酶促交聯(lián)魚糜凝膠提供了技術(shù)指導(dǎo)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種鑒定魚糜凝膠中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的交聯(lián)位點的分析方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase，EC.2.3.2.13)作為一種被美國魚糜藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證安全的魚糜添加劑，能催化蛋白質(zhì)上賴氨酸的ε-氨基與谷氨酸的γ-羥酰氨基形成共價鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的共價交聯(lián)，增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，常被用于添加到食物中改善魚糜的質(zhì)構(gòu)特性，尤其在魚糜制品領(lǐng)域應(yīng)用頗多。肌原纖維蛋白是魚糜肌肉中的主要蛋白質(zhì)，在加熱條件下肌原纖維蛋白發(fā)生凝膠化，使魚糜蛋白表現(xiàn)出液體黏性和固體彈性兩種形態(tài)之間的性質(zhì)，從溶膠狀態(tài)變成高黏彈性的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在魚糜制品的生產(chǎn)過程中，常利用魚肉內(nèi)含的內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及添加的外源性微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶促進(jìn)肌球蛋白產(chǎn)生ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸(ε-(γ-glutamyl)lysine，G-L)異肽鍵交聯(lián)，從而增強(qiáng)魚糜制品的質(zhì)構(gòu)特性。目前已有研究表明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶導(dǎo)致的G-L異肽鍵交聯(lián)可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象及凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步會影響食物的消化特性和營養(yǎng)特性，而其內(nèi)在原因尚不明確。隨著人們生活水平的提高和對食物健康和營養(yǎng)需求的提高，對食物的消化吸收特性的研究非常迫切，因此從分子層面了解G-L異肽鍵交聯(lián)位點對于研究交聯(lián)結(jié)構(gòu)對消化特性的影響機(jī)制具有非常重要的意義。

目前，蛋白組學(xué)技術(shù)，如化學(xué)交聯(lián)結(jié)合質(zhì)譜的方法常被用來研究化學(xué)交聯(lián)的位點。這些方法通常利用同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記等方法標(biāo)記特定的氨基酸或蛋白質(zhì)，然后在已知交聯(lián)規(guī)律的情況下列出可能發(fā)生交聯(lián)后的肽段的分子量，利用質(zhì)譜鑒定的結(jié)果進(jìn)行匹配計算，或利用已有的商業(yè)軟件對發(fā)生交聯(lián)的位點和交聯(lián)產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行鑒定。然而這些方法很少利用到鑒定食物中的交聯(lián)位點，因為食物中的成分非常復(fù)雜，利用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定食物中發(fā)生交聯(lián)的位點可能面臨很多困難：1)可發(fā)生交聯(lián)的位點很多，較難預(yù)測；2)發(fā)生交聯(lián)后的產(chǎn)物復(fù)雜，分子量跨度大；3)交聯(lián)后的片段在被胰蛋白酶消化后不能被平均水解，產(chǎn)生的豐度較低的肽段容易被忽視。綜上，利用蛋白組學(xué)技術(shù)較難直接對食物中產(chǎn)生交聯(lián)的聚合物及發(fā)生交聯(lián)的位點進(jìn)行鑒定。并且，由于胰蛋白酶無法水解G-L異肽鍵交聯(lián)，因此通過直接鑒定交聯(lián)后聚合物氨基酸序列的方法分析交聯(lián)位點非常復(fù)雜，目前國內(nèi)外關(guān)于此內(nèi)容的研究幾乎沒有。

在研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的G-L異肽鍵交聯(lián)位點的領(lǐng)域，目前國內(nèi)外研究中僅能鑒定到交聯(lián)所屬的大致區(qū)域，如肌原纖維蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)中的S1區(qū)域(subfragment-1,S1)，S2區(qū)域(subfragment-2,S2)或輕酶解肌球蛋白區(qū)域(lightmeromyosin,LMM)，而不能精確到具體的氨基酸位點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定魚糜凝膠中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的交聯(lián)位點的分析方法，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鑒定魚糜凝膠中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的交聯(lián)位點的分析方法，根據(jù)未發(fā)生G-L交聯(lián)的賴氨酸的一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，不含G-L交聯(lián)，被胰蛋白酶水解后含有賴氨酸的肽段會被鑒定到，與谷氨酰胺發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)的賴氨酸的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，被胰蛋白酶水解后的肽段不會被鑒定到，測定魚糜凝膠中ε-氨基相對于生魚糜中ε-氨基的減少量獲得數(shù)據(jù)結(jié)果，對所述數(shù)據(jù)結(jié)果在對應(yīng)的物種庫中進(jìn)行檢索，鑒定得到置信區(qū)間在95％以上的肽段序列，并在相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列上進(jìn)行標(biāo)記；將魚糜凝膠中未被鑒定到的賴氨酸與未發(fā)生交聯(lián)的生魚糜中未被鑒定到的賴氨酸進(jìn)行比較，額外增加的賴氨酸即為發(fā)生交聯(lián)的賴氨酸。