[發(fā)明專利]一種利用大腸桿菌高效表達并分泌人生長激素的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011161350.8
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112266924A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳劍清;王可盈;蓋其靜
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)紹興生物醫(yī)藥研究院有限公司;浙江理工大學(xué);浙江清肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C12N15/67;C12N1/21;C07K14/61;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C12R1/19
• 代理公司: 浙江納祺律師事務(wù)所 33257
• 代理人: 鄭滿玉

1.一種重組人生長激素核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列依次包含限制性酶酶切切位點1、核糖體結(jié)合位點、信號肽編碼區(qū)、人生長激素編碼區(qū)hGH、限制性內(nèi)切酶酶切位點2，其中，信號肽為大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素Ⅱ信號肽編碼序列SEQ ID NO：1，人生長激素編碼區(qū)hGH編碼序列為SEQ ID NO：2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人生長激素核苷酸序列，其特征在于，所述限制性酶酶切位點1為-XbaI酶切位點，所述限制性內(nèi)切酶酶切位點2為XhoI酶切位點，重組人生長激素核苷酸序列為SEQ ID NO：3。

3.一種含有權(quán)利要求1或2所述的重組人生長激素核苷酸序列的重組表達載體，其特征在于，重組表達載體含有重組人生長激素核苷酸序列，通過將所述重組人生長激素氨基酸序列經(jīng)過雙酶切后插入到載體pET28a(+)獲得重組表達載體。

4.一種含有權(quán)利要求3所述的重組表達載體表達人生長激素蛋白的工程菌，其特征在于，所述工程菌為含有重組表達載體的大腸桿菌BL21。

5.一種利用權(quán)利要求4所述的工程菌表達人生長激素蛋白的方法，其特征在于表達方法包括以下步驟：a)將工程菌按1:100(v/v)接種；b)置于37攝氏度條件下培養(yǎng)3-5小時，加入1mM IPTG，在25-30攝氏度條件下誘導(dǎo)3-5小時；c)低溫離心收集表達了人生長激素蛋白的菌體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達人生長激素蛋白的方法，其特征在于，培養(yǎng)大腸桿菌所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達人生長激素蛋白的方法，其特征在于，在37攝氏度培養(yǎng)3-4小時后，然后加入1mM IPTG繼續(xù)28攝氏度誘導(dǎo)3-5小時。

8.一種利用權(quán)利要求5或6或7所述的人生長激素蛋白的菌體純化重組人生長激素的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)將步驟c)所得的菌體進行超聲破碎或低溫凍融破碎，離心收集上清；

2)30kD超濾管超濾，取穿透液，穿透液經(jīng)5kD超濾管超濾取截留液；

3)將步驟2)獲得的截留液過Q離子交換柱，洗滌液洗滌得到純化的hGH蛋白。