[發(fā)明專利]一種連續(xù)多位點基因突變檢測和分型的方法、應(yīng)用及試劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011160182.0
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112210590A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閆科技
• 申請（專利權(quán)）人: 鯤羽生物科技（江門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京捷誠信通專利事務(wù)所(普通合伙) 11221
• 代理人: 王衛(wèi)東;萬善書

1.一種連續(xù)多位點基因突變檢測和分型的方法，其特征在于，包括以下步驟：

針對基因組特定區(qū)域中可能發(fā)生突變的連續(xù)N個突變位點中的每一個，分別設(shè)計由一組四個正向引物組成的引物組，同時在突變位點的下游設(shè)計一個通用的反向引物，形成PCR反應(yīng)的引物對，其中，針對第一個突變位點利用突變位點旁邊的未突變保守序列設(shè)計第一引物組中的四個正向引物，其后的第N個引物組中的四個兼并引物中，3’端第一個堿基對應(yīng)第N突變位點，第二個堿基對應(yīng)第N-1突變位點，第三個堿基對應(yīng)第N-2突變位點，且除第一個堿基之外的其余對應(yīng)突變位點的堿基均為隨機(jī)兼并序列，每個引物組的四個引物的3’端第一個堿基分別為ATCG，以此類推，形成一系列引物組合；

對組織樣品進(jìn)行裂解或者進(jìn)行基因組DNA提取，然后以裂解液或者DNA為模板，以上述引物組所包含的引物作為引物對，進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

通過實時熒光PCR儀對PCR反應(yīng)進(jìn)行實時信號檢測，通過反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線以及溶解曲線，對突變信息和基因分型情況進(jìn)行確定；

N為正整數(shù)，且N大于等于2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，N＝3時，設(shè)計所述正向引物的具體步驟如下：

第一步：以該DNA的第一個突變位點一側(cè)的保守序列設(shè)計第一組四個正向引物，其中四個引物的3’端第一個堿基對應(yīng)第一個突變位點；

第二步：設(shè)計第二組四個兼并引物，其中引物的3’端第一個堿基對應(yīng)該DNA的第二個突變位點，而3’端第二個堿基為隨機(jī)兼并序列來對應(yīng)第一個突變位點；

第三步：設(shè)計第三組四個兼并引物，其中引物的3’端第一個堿基對應(yīng)該DNA的第三個突變位點，第二個堿基為隨機(jī)兼并序列來對應(yīng)第二個突變位點，第三個堿基為隨機(jī)兼并序列來對應(yīng)第一個突變位點。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，各引物組中的引物的3’端第一個堿基分別為ATCG，且除第一個堿基之外的其余對應(yīng)突變位點的堿基均為隨機(jī)兼并序列。

4.權(quán)利要求1所述的方法在檢測人基因組中一突變位點及分子分型中的具體實施應(yīng)用。

5.一種用于連續(xù)多位點基因突變檢測和分型的試劑，其特征在于，包括：

N組正向引物和一組通用的反向引物，所述N組正向引物分別對應(yīng)DNA的的N個突變位點，其中：第一個突變位點采用保守序列設(shè)計第一引物組中的四個正向引物，其后的第N個引物組中的四個兼并引物中，3’端第一個堿基對應(yīng)第N突變位點，第二個堿基對應(yīng)第N-1突變位點，第三個堿基對應(yīng)第N-2突變位點，且除第一個堿基之外的其余對應(yīng)突變位點的堿基均為隨機(jī)兼并序列；

N為正整數(shù)，且N大于等于2。

6.一種用于連續(xù)多位點基因突變檢測和分型的試劑，其特征在于，還包括：用于組織裂解或者基因組DNA提取的試劑；用于熒光PCR反應(yīng)的PCR試劑；以及用于質(zhì)控的陰性對照樣品和陽性對照樣品。