[發明專利]堿性蛋白酶低溫突變體及其在污泥處理中的應用

有效

• 申請號: 202011158007.8
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112280768B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 林小麗
• 申請（專利權）人: 林小麗
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C02F11/02
• 代理公司: 東莞市神州眾達專利商標事務所(普通合伙) 44251
• 代理人: 周松強

本發明提供了堿性蛋白酶低溫PB92的突變體SPL?12、SPL?17，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1?3；相比親本酶，SPL?12、SPL?17提供了改善的穩定性和低溫性能，適用于堿性污泥產酸處理過程。

技術領域

本申請屬于蛋白領域和環保領域，具體地，本發明提供了堿性蛋白酶PB92的低溫突變體SPL-12、SPL-17，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1-3；相比親本酶，SPL-12、SPL-17提供了改善的穩定性和低溫性能，適用于堿性污泥產酸處理過程。

背景技術

污水處理的常用方法均包括將水中污染物、有機物、微生物等轉移到污泥中以潔凈水體的步驟，因此富含污染物、有機物、微生物的污泥的處理便成為了污水處理中的最關鍵和最根本的步驟，其處理成本占到污水處理成本的一半以上，也是污染排放達標的根本。

目前常用的污泥處理方式為填埋、自然干化、高溫焚燒等，這些方法不僅有較高的二次污染風險，而且土地、燃料等成本也日益成為處理企業和政府的負擔。為降低污泥處理的成分以及提高處理的可持續性，污泥的資源化是必然的選擇，歐洲發達國家中污泥厭氧發酵處理占污泥處理總量的50％左右。

無論是以甲烷為產品的厭氧發酵還是以有機酸為產品的厭氧發酵，多需要水解以破解微生物細胞和胞外聚合物以提高厭氧發酵速率和效率，目前可用的酶包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶等(Dai XH et al.Simultaneous enhancement ofmethaneproduction and methane content in biogas from waste activated sludgeand perennial ryegrass anaerobic co-digestion:the effects of pH and C/Nratio，Bioresource Technology，2016，216：323-330)。其中的蛋白酶是破壞污泥中的團聚物的主要作用酶，對破壞細胞也有作用。目前污泥處理中可使用的蛋白酶多為中性和酸性蛋白酶，對于呈堿性的污泥，如印染企業和某些有色金屬冶煉加工企業的污泥以及經過堿處理的污泥效果不佳。

發明內容

為解決上述問題，申請人嘗試使用了常見的PB92堿性蛋白酶處理污泥，發現蛋白溶出效果和產酸效果均不理想，推測原因是PB92的穩定性不佳造成作用時間超過2小時后酶活降低。隨后申請人通過易錯PCR的方法篩選PB92的穩定性變體，特別是低溫穩定性改善變體，獲得的SPL-12、SPL-17在此方面有明顯的改善，用于污泥溶解時蛋白溶出效果和產酸量都有明顯提高。

一方面，本申請提供了一種堿性絲氨酸蛋白酶變體，其在氨基酸序列為SEQ IDNO.1的堿性絲氨酸蛋白酶基礎上引入了選自S76D、P129E、S130K、G260H、S130A、A166D的突變。

進一步地，所述變體的穩定性提高。

進一步地，突變為S76D、P129E、S130K和G260H組成的組，或者P129E、S130A和A166D組成的組。

進一步地，變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

進一步地，變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.3。

另一方面，本申請提供了上述變體在污泥處理中的應用。

進一步地，所述污泥為堿性污泥。

進一步地，所述污泥處理為發酵產酸。

進一步地，所述變體處理污泥促進蛋白和多糖的溶出。

本申請中的變體可以通過本領域公知的分子生物學和發酵工程方法生產，使用的宿主菌可以為分子生物學和發酵工程中的常用種類，包括但不限于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌。