[發明專利]水禽多種致病菌的多重PCR檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202011155962.6
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112195258B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 蒲齡;張亞楠;徐景峨;彭珊;陳浩林;李婷;楊莉;楊茂生;劉林洋
• 申請（專利權）人: 貴州省畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/44;C12R1/01
• 代理公司: 昆明盈正知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53208
• 代理人: 徐洪剛

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及水禽多種致病菌的多重PCR檢測試劑盒及其應用，試劑盒包括：鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌和葡萄球菌DNA提取液，鴨疫里氏桿菌ompA?F/R引物，巴氏桿菌kmt?F/R引物，大腸桿菌phoA?F/R引物，大金黃色葡萄球菌invA?F/R引物，10×PCR反應緩沖液，Pfu PCR mix，ddH₂O；本發明建立了一種能夠同時檢測鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌4種水禽源主要致病細菌的多重PCR檢測方法，具有經濟快捷、高效、特異性強、重復性好的特點，可用于快速檢測水禽主要致病菌。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及水禽多種致病菌的多重PCR檢測試劑盒及其應用。

背景技術

我國是水禽的養殖與消費大國，養殖量占世界總量的80％以上，由于養殖中依舊保留著放牧和游水的生活習性，同時受環境控制和養殖水平等因素影響,導致細菌性疾病高發,嚴重威脅著水禽產業的發展。

鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、葡萄球菌是目前引起水禽細菌性疾病的檢出率最高的致病性細菌，發病率和致死率極高，均能引起水禽的共濟失調、神經癥狀。鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌能引起纖維性心包炎和的癥狀，能進入血腦屏障引起腦膜炎和神經癥狀；鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌和葡萄球菌能引起水禽的關節腫脹、癱瘓。鴨疫里氏桿菌和巴氏桿菌能引起水禽的大量死亡，病程短。從近年水禽的流行病學調查表明多種病原的混合感染和繼發感染普遍存在，因此臨床剖檢很難迅速確定病因。

在細菌分離鑒定上，鴨疫里氏桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌和葡萄球菌能在含血清的TSA培養基上生長，菌落形態相似不易辨別，而使用革蘭氏染色法不能快速辨別鴨疫里氏桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌(上述3種細菌為革蘭氏陰性菌)，傳統生化試驗周期較長。

因此精確、高效的病原學檢測是對水禽常見細菌性疾病開展診斷和綜合防治的關鍵環節。

發明內容

本發明的目的是針對背景技術中的問題，提供一種能同時檢測鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌的葡萄球菌的檢測試劑盒，利用該試劑盒進行四種致病菌的檢測，具備節約成本、高效率的特點。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：本發明的第一目的是提供能檢測水禽多種致病菌的多重PCR檢測試劑盒，所述多種致病菌為鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、葡萄球菌，所述試劑盒包括：鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌和葡萄球菌DNA提取液，鴨疫里氏桿菌ompA-F引物、鴨疫里氏桿菌ompA-R引物、巴氏桿菌kmt-F引物、巴氏桿菌kmt-R引物、大腸桿菌phoA-F引物、大腸桿菌phoA-R引物、金黃色葡萄球菌invA-F引物、金黃色葡萄球菌invA-R引物，10×PCR反應緩沖液，Pfu PCR mix，ddH₂O；引物序列如SEQ ID No.1-8所示。

進一步的，所述試劑盒多重PCR反應體系為：DNA提取液各1μL、每個所述引物1μL、ddH₂O 16μL和Pfu PCR mix 25μL。

進一步的，所述試劑盒的多重PCR的反應條件為：95℃預變性5min，94℃30s，54℃40s，72℃50s擴增30個循環；72℃延伸10min。

本發明試劑盒的使用方法包括如下步驟：

(1)提取待測樣品DNA；

(2)利用上述試劑盒進行多重PCR；

(3)將PCR后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，進行結果判定，結果判定為：若出現770bp、543bp、428bp和231bp條帶，則表明樣品中含有鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌和葡萄球菌。其中未出現的條帶片段長度則對應的致病菌未出現。

對本領域技術人員來說，本發明試劑盒應用于水禽多種致病菌中多重PCR檢測也應該屬于本發明保護的技術范圍。