[發明專利]一種對PRRSV具有特異性免疫刺激作用的CpG-ODN及其應用

有效

• 申請號: 202011155158.8
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112322626B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 馮璥;李濤;何文彬;呂雪梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C12N15/117
• 分類號: C12N15/117;C12N15/85;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 吳金姿

本發明涉及一種對PRRSV具有特異性免疫刺激作用的CpG?ODN及其應用，通過以篩選出11個CpG?ODN片段，將篩選出的11個CpG?ODN片段首尾相連形成含有許多以?CG?二核苷酸為一個CpG基元的DNA序列，命名為“Multi?CpG”。將以?GTCGTT?作為一個CpG基元的DNA序列替換上述“Multi?CpG”中長度相同的一段DNA序列，命名為“Multi?CpG?Mix”。將“Multi?CpG”兩個與“Multi?CpG?Mix”一個，進行首尾相連，獲得含有兩種免疫激活單元的DNA序列，命名為“Multi?CpG?Mixture”。將“Multi?CpG?Mixture”通過XbaI和EcoRI兩個酶切位點插入多拷貝克隆載體Puc19衍生載體FVX中，以基因合成的手段構建重組質粒FVX?Multi?CpG?Mixture。不僅能誘導豬體內天然免疫功能激活，還能激活豬體內對PRRSV的獲得性免疫功能，提高豬體內對PRRSV的免疫反應誘發作用，降低PRRSV發病率，降低豬養殖成本。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其是一種對PRRSV具有特異性免疫刺激作用的CpG-ODN及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的致病因子，是引起母豬繁殖障礙及新生仔豬呼吸道癥狀和高死亡率的新RNA病毒傳染病病毒。PRRSV最早于1987年在美國發現，1991年荷蘭人Wensvoot首次從發病仔豬和母豬體內分離到了該病毒，隨后德國、美國、英國等也分離到了該病毒。目前，該病毒已遍及北美洲、歐洲，在全球范圍內傳播，且各地相繼發生流行性感染，給養豬行業造成嚴重的經濟損失。雖然，豬繁殖與呼吸綜合征滅火病毒疫苗已經得到了廣泛使用，但伴隨有副作用，且僅有部分免疫保護作用，使得對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫保護效果不理想。

CpG基序(CpG motifs)是指一類以非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤(-CG-)二核苷酸為一個CpG基序的DNA序列，即就是免疫激活單元。大量研究表面：CpG基序是一種強有力的非特異性免疫刺激DNA序列，能夠直接或間接激活T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞。將含有CpG基序的DNA稱為CpG-DNA，將人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核糖核苷酸(ODN)稱為CpG-ODN。經合成CpG-ODN進行試驗研究，發現細菌DNA的免疫刺激作用，僅與其中具有特異性側翼的非甲基化CpG核苷酸有關；與細菌DNA不同，哺乳動物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用。哺乳動物和其他脊椎動物DNA分子中CpG基序出現的頻率很低，且60-90％的CG基序中胞嘧啶第五碳原子發生甲基化。

在1995年，Arthur M.Krieg等人通過分析人工合成的不同序列CpG-ODN的免疫刺激活性，得出：CpG-ODN需有一定的長度，在一個CpG-ODN中可以有一個或多個CpG基序，CpG基序兩側特異的嘌呤和嘧啶以及CpG基序之間相隔堿基的不同，都會影響CpG基序的免疫刺激類型和強度。因此，有研究者就豬先天性及獲得性免疫的有效提升，提供了一種CpG-ODN以及含有該CpG-ODN的重組質粒、制劑，例如專利申請號為201910229571.5的對豬具有特異性免疫刺激作用的CpG-ODN及其作用中的報道，該報道中研究了CpG基序個數(含-CG-基元個數)對CpG-ODN的免疫刺激作用和強度等。在“Zhu,H.F.,Li,G.F.,Zhu,J.Z.,Lu,C.,Shao,G.Q.,Zhang,Z.S.,2003.Difference between immunostimulation activity of K and Dtypes of CpG oligodeoxynucleotides in peripheral blood mononuclear cells ofporcine.Acta NanJing Med.Univ.23,542–544.”中報道：具有免疫激活作用的CpG基序還包括以-GTCGTT-作為一個CpG基元的DNA序列：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT。但是，對于同時含有兩種免疫激活單元(-CG-基序和-GTCGTT-基序)的免疫刺激活性如何，目前還未見有相關報道。

發明內容