[發明專利]梯度調控芽胞桿菌啟動子啟動效率的序列組合及應用

有效

• 申請號: 202011153718.6
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112226437B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 陳守文;饒憶;蔡冬波;馬昕
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明涉及基因工程和微生物蛋白表達領域，公開了梯度調控芽胞桿菌啟動子啟動效率的序列組合及應用。本發明以地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽合成基因簇啟動子PbacA為基礎，將啟動子PylB、Pndh的5’UTR分別替換PbacA的5’UTR、以獲得一組適用于芽胞桿菌的強、中和弱啟動子（PUbay、PbacA、PUndh）。接著，以綠色熒光蛋白GFP、紅色熒光蛋白GFP、角蛋白酶KER為目的蛋白，梯度型啟動子PUndh(弱)、PbacA(中)、PUbay(強)分別實現不同蛋白在不同芽胞桿菌(地衣芽胞桿菌DW2、解淀粉芽胞桿菌HZ?12、枯草芽胞桿菌168)中的不同表達水平的表達。

技術領域

本發明涉及基因工程和微生物蛋白表達領域，具體涉及梯度調控芽胞桿菌啟動子啟動效率的序列組合及應用。

背景技術

啟動子是位于基因轉錄單元上游的一段特殊DNA序列，具有啟動基因轉錄的功能，并在調控基因轉錄水平中發揮著重要的作用。隨著合成生物學和代謝途徑工程的發展，人們逐漸發現，為了實現目標產物的高產，平衡工程菌株生長和生產的代謝通量是至關重要的，從而開發精準調控蛋白表達水平和代謝物代謝途徑的工具成為了研究熱點。由于啟動子是基因轉錄的開關，從而其被認定為是建立基因精準調控工具的首選表達元件。目前，基因精準調控工具主要包括：靜態調控系統、動態調控系統。其中，靜態調控系統主要是利用梯度強度的啟動子文庫來實現對目的基因精準調控的目的，其構建策略主要啟動子改造(DOI:10.1021/acssynbio.7b00258)、組學篩選(DOI:10.1016/j.cbpa.2012.12.008)等；而動態調控系統主要以誘導型啟動子為基礎，通過添加不同劑量的誘導劑實現對目的基因精準調控的目的(DOI:10.1021/acs.jafc.8b02857)。

地衣芽胞桿菌是一個重要的工業生產模式菌株，具有分泌蛋白能力強特征，且被美國FDA認定為生物安全性菌株，從而其可作為蛋白和目標代謝物生產的優良宿主。目前，其已經實現多種蛋白和代謝物高效生產，如α-淀粉酶、堿性蛋白酶，桿菌肽等。然而其至今仍然缺乏基因表達精準調控的有效工具，從而大大限制了地衣芽胞桿菌蛋白高效表達和目的產物高產的代謝工程育種平臺的建立。

本實驗室，前期研究發現，地衣芽胞桿菌DW2內源性啟動子PbacA是一個活性強且穩定的表達元件。如王等人利用PbacA強化普切明合成途徑酶，使產量達到550mg/L，為目前報道最高表達水平(DOI:10.1128/AEM.03041-19)。從而，本研究中，我們以PbacA為基礎，采用靜態調控思想，構建一個梯度強度的PbacA啟動子突變體(PUbay、PbacA、PUndh)。然后，在不同芽胞桿菌中，為精準調控蛋白表達水平和代謝產物合成水平提供了一個有效的工具。并且，為構建芽胞桿菌蛋白高效表達體系和目的產物高產的代謝工程育種奠定基礎。

發明內容

本發明的目的是提供了梯度調控芽胞桿菌啟動子啟動效率的序列組合，所述的啟動子序列組合為SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

本發明的另一個目的是提供了適用于芽胞桿菌的梯度型啟動子在調控蛋白表達水平中的應用，將本發明的啟動子導入芽胞桿菌中，可精準調控目的產物表達水平。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

梯度調控芽胞桿菌啟動子啟動效率的序列組合，為：SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2；和SEQ ID NO.3所示。

上述的序列組合在梯度調控芽胞桿菌外源蛋白表達量中的應用；

以上所述的應用，其應用過程是將上述序列分別替換目的啟動子的5’UTR；

以上所述的應用，優選的，所述的芽胞桿菌為地衣芽胞桿菌，解淀粉芽胞桿菌或枯草芽胞桿菌；

以上所述的應用，優選的，所述的外源蛋白為綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白和角蛋白酶。與現有技術相比，本發明具有以下優點：