[發明專利]一株分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 202011152852.4
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112280745B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 胥傳來;劉杰;匡華;徐麗廣;孫茂忠;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲;郝昌龍;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K14/765;C07D237/18;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于免疫檢測技術領域。本發明公開了一株分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株ABC05，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏編號CGMCC No.19174。將噠螨靈的完全抗原免疫BALB/c小鼠。將高效價，低IC₅₀小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，將融合后的雜交瘤細胞通過培養基培養，再經過間接競爭酶聯免疫法篩選細胞并三次亞克隆，最終得到一株單克隆抗體雜交瘤細胞株。此細胞株分泌的單克隆抗體，對噠螨靈具有較好的檢測靈敏度（IC₅₀值為9.09 ng/mL），可用于食品中噠螨靈的殘留檢測。

技術領域

本發明涉及一株分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于免疫檢測技術領域。

背景技術

噠螨靈的英文通用名為：Pyridaben，中文名又稱：牽牛星、速螨酮、噠螨酮，化學名稱：2-叔丁基-5-(4-叔丁芐基硫)代-4-氯-3(二氫)噠嗪酮；作用機理：噠螨靈屬于噠嗪酮類殺蟲、殺螨，它觸殺性極強，但是沒有熏蒸、內吸和傳導作用。它主要是抑制肌肉組織、神經組織和電子傳遞系統染色體I中谷氨酸脫氫酶的合成，從而發揮殺蟲作用。主要用途：對所有食植性害螨都具有明顯的防治效果，比如全爪螨、葉螨、合癭螨、小爪螨等，而且在螨的不同生長期都有效，例如在螨的卵期、若螨期、成螨期，在成螨的移動期也有防治效果。在我國主要用于柑桔、蘋果、梨、山楂等水果作物上，在蔬菜(茄子除外)、煙草、茶葉、棉花、及觀賞植物上也可使用。

目前，噠螨靈檢測方法主要為儀器檢測，常用的有氣相色譜法、液相色譜法和氣相色譜-質譜法。盡管這些基于色譜的方法具有很高的靈敏度和特異性，但存在一些缺點，例如需要徹底的樣品凈化，高溶劑消耗，昂貴的設備以及熟練的技術人員。因此，還需要一種快速，簡單的分析噠螨靈殘留物的方法。

酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的前處理簡單、純化步驟少、分析容量大、檢測成本低而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測，因此在農藥殘留分析中得到了廣泛應用。而使用酶聯免疫法檢測噠螨靈的前提是得到對噠螨靈具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體，因此，找到一種制備對噠螨靈具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體的方法十分關鍵。

發明人嘗試通過雜交瘤細胞制備噠螨靈單克隆抗體，但在制備能分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株的過程中，如何制備噠螨靈半抗原和噠螨靈完全抗原、如何使小鼠產生強免疫，還需進一步的研究；如何使得制備出的雜交瘤細胞株能夠成功分泌出噠螨靈單克隆抗體，還需進一步的研究；如何使得分泌出的噠螨靈單克隆抗體特異性強、靈敏度高，也還需進一步的研究。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，提供一株分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用。此雜交瘤細胞株分泌的噠螨靈單克隆抗體對噠螨靈具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC₅₀值為9.09ng/mL），可以用于建立噠螨靈的免疫學檢測方法，檢測食品中噠螨靈的殘留。

本發明的技術方案，一株分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株ABC05，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏編號CGMCC No.19174。

本發明提供了上述一種分泌噠螨靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制備方法，包含如下步驟：

（1）制備噠螨靈半抗原及噠螨靈完全抗原，將獲得的噠螨靈完全抗原制備成含抗原的弗氏佐劑與不完全弗氏佐劑；

（2）將得到的噠螨靈完全抗原弗氏佐劑通過背部皮下注射，注射進入BALB/c小鼠體內進行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐劑，加強免疫采用不完全弗氏佐劑；