[發(fā)明專利]一種綠藻植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用

有效

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• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112094861B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發(fā)明（設計）人: 張瑜;孫金苗;楊冰燕;董亦馨;李迅;王飛
• 申請（專利權）人: 南京林業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12P21/02;C07K14/405;C07K1/14;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/16;A61K31/352;A61K47/69
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 李建芳

本發(fā)明公開了一種綠藻植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用，綠藻植物鐵蛋白的表達純化方法，包括如下步驟：(1)重組蛋白表達工程菌的構建；(2)重組蛋白的表達和收獲；(3)重組蛋白的分離純化。本發(fā)明提供的綠藻植物鐵蛋白安全，無毒副作用，還具有良好的補鐵效果，在自然界中分布廣泛；本發(fā)明所得的綠藻植物鐵蛋白作為一種新的載體具有很好的應用前景，拓寬了鐵蛋白的研究范圍；將黃酮類化合物包封在蛋白質內部極大地提高了非水溶性生物活性物質的水溶性、穩(wěn)定性、生物利用度，提高了生物活性物質在食品，醫(yī)療，保健等方面的應用。

技術領域

本發(fā)明涉及一種綠藻植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用，屬于植物鐵蛋白技術領域。

背景技術

黃酮類化合物在自然界中分布廣泛，具有多種生物活性，存在于大多數植物體內，對于植物的生長、開花、結果、以及抑菌治病方面起重要的作用。此外，黃酮類化合物還有一定的藥用價值，在降血脂、降膽固醇、預防老年高血壓、腦溢血、治療冠心病、抗腫瘤、抗氧化自由基活性等方面具有重大意義。近幾年來，隨著分離提取工藝的進步和完善，越來越多的新型黃酮類化合物被開發(fā)利用，吸引了越來越多人的關注。然而，由于黃酮類化合物水溶性差，對光、熱、pH的敏感性導致其穩(wěn)定性下降，生物利用度降低，限制了其在食品，醫(yī)藥等方面的廣泛應用。因此，如何提高黃酮類化合物的水溶性和穩(wěn)定性，以提高其生物利用度是亟需解決的問題。

鐵蛋白廣泛存在于動物、植物、微生物中，是一種貯鐵蛋白，幾乎存在于所有植物的體細胞中。成熟植物鐵蛋白N端的一段EP螺旋肽可以維持鐵蛋白整體的穩(wěn)定性，也參與蛋白質內部礦物質核的形成和鐵的釋放。此外，來源于植物型的鐵蛋白是一種良好的補鐵試劑，安全、無毒、補鐵效果好。植物鐵蛋白由24個亞基自組裝形成一個中空籠狀結構，外部直徑12nm，內部直徑8nm，呈4-3-2重軸對稱，植物鐵蛋白中只有H型亞基，H-1和H-2型亞基擁有80％同源性，在極端酸性/堿性條件下容易發(fā)生解聚，在中性條件下聚合。目前，動物鐵蛋白已經得到廣泛深入的研究，但對植物鐵蛋白的研究尚淺，植物鐵蛋白無毒，補鐵效果好，因此開發(fā)一種新型的植物鐵蛋白是必不可少的。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供一種綠藻植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用，所得綠藻重組植物蛋白為新型籠狀鐵蛋白，可用于生物活性物質的裝載，拓寬了鐵蛋白的研究范圍；此外，在蛋白籠的保護下，解決了黃酮類化合物水溶性低、不穩(wěn)定等難題，提高黃酮化合物的生物利用度以及穩(wěn)定性。

為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

一種綠藻植物鐵蛋白的表達純化方法，包括如下步驟：

(1)重組蛋白表達工程菌的構建：

將綠藻鐵蛋白的基因序列亞克隆至質粒載體中，即得到含有目的基因的質粒，將該質粒熱激轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性單克隆轉化子，將陽性單克隆轉化子熱激轉化至大腸桿菌中，挑取單菌落獲得重組蛋白表達工程菌；

(2)重組蛋白的表達和收獲：

將步驟(1)所得的重組蛋白表達工程菌接種于含氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD600＝2時，加入IPTG誘導，離心收菌；

(3)重組蛋白的分離純化：

將步驟(2)得到的菌體超聲破碎后離心取上清，采用親和層析法對目的蛋白和其余雜蛋白進行分離純化，柱上酶切去除GST標簽后，再通過體積排阻色譜對重組的目的蛋白進一步純化，最終得到綠藻重組植物蛋白。

本發(fā)明采用的方法包括采用pGEX表達系統(tǒng)，以E.coli BL21(DE3)為表達菌株，表達出帶GST標簽的可溶性蛋白，標簽切除得到最終目的蛋白等步驟。通過本發(fā)明制備的重組蛋白可以應用于生物活性化合物、抗腫瘤藥物的裝載等方面以提高非水溶性化合物的溶解度、生物利用度及靶向性。

上述步驟(1)中，綠藻植物鐵蛋白的編碼基因的序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。