[發明專利]一種無接觸貼壁細胞三維形態測量方法及細胞封接方法

有效

• 申請號: 202011151720.X
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112305209B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 趙啟立;趙新;韓宇;賈祎晴;邱金禹;于寧波;孫明竹
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: G01N33/487
• 分類號: G01N33/487;G01N15/10;G01B7/28
• 代理公司: 天津睿勤專利代理事務所(普通合伙) 12225
• 代理人: 孟福成

本發明涉及一種無接觸貼壁細胞三維形態測量方法及細胞封接方法，包括以下步驟：(1)對電極接近貼壁細胞上表面的過程進行電學仿真，確定電極距細胞表面距離與檢測電阻上升的關系曲線；(2)提取細胞輪廓，并通過對細胞表面上5個點的無接觸高度檢測結果擬合細胞三維形態；(3)對電極進行三維定位，并根據細胞三維形態信息確定細胞表面上能夠最大程度覆蓋電極口的接觸點位置；(4)控制電極移動到設定接觸點處接觸細胞表面，接觸細胞，下降壓入細胞膜并完成細胞封接。本發明所述細胞三維形態測量方法中，電極堵塞幾率低，保證了后續細胞封接操作的正常進行。本發明所述的細胞封接方法可實現70％的封接成功率。

技術領域

本發明涉及細胞級別的顯微操作領域，具體涉及一種無接觸貼壁細胞三維形態測量方法及細胞封接方法。

背景技術

膜片鉗技術是細胞電生理信號測量的“金標準”。膜片鉗操作中操作者使用內徑1μm以下的玻璃電極將一小部分細胞膜吸入電極微管內，對膜中單離子通道開閉產生的PA級別的電流進行測量。在膜片鉗信號記錄前需要使細胞膜和電極之間形成GΩ級的封接，稱為高阻封接。高阻封接是將細胞膜與周圍環境進行有效的電隔離的保證，是實現高信噪比的細胞電生理信號測量的前提條件。因此提高細胞高阻封接(以下簡稱封接)成功率是提高膜片鉗操作效率的關鍵。

當前的貼壁細胞封接主要由操作者手動完成，對操作者的專業水平依賴較大，貼壁封接成功率從30％到60％不等。為了提高封接成功率，應該在進行吸持前盡量增大電極口被細胞膜覆蓋面積比例。由于細胞表面呈突起的形狀，這就需要在細胞表面上選擇合適的接觸點，使得電極口與細胞表面基本處于平行狀態。選擇上述合適的接觸點需要對細胞的三維形態信息進行檢測。

現有的細胞三維形態測量方法及其缺陷：(1)原子力顯微鏡法：通過使用探針敲擊細胞表面繪制細胞的三維形態，但是把電極安裝到探針上是一項極具挑戰性的工作；(2)共聚焦顯微鏡法：通過逐層掃描經過染色的細胞結構，堆積形成細胞三維結構，但是使用共聚焦顯微鏡進行細胞三維測量往往需要較長的時間，而且長時間的曝光也會導致熒光漂白等問題；(3)電極接觸測量法：使用電極接觸細胞表面通過圖像處理檢測細胞變形獲得細胞高度信息，但是使用電極多次接觸細胞表面很容易導致電極堵塞，繼而失去進行細胞封接的能力。因此開發一種無接觸的簡易細胞三維形態測量方法，并利用測得細胞三維形態選擇合適的接觸點進行細胞封接，對于提高細胞封接成功率十分關鍵。

發明內容

本發明提出了一種無接觸貼壁細胞三維形態測量方法及細胞封接方法，該方法利用檢測電極電阻值的變化趨勢實現貼壁細胞表面高度的無接觸測量，通過采樣點處獲得細胞高度擬合出整個細胞的三維形態，并根據細胞三維形態確定細胞表面上能使電極口被細胞膜以較大比例覆蓋的接觸點，并在此點處進行高成功率的貼壁細胞封接。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種無接觸貼壁細胞三維形態測量方法，包括以下步驟：

S1，通過細胞輪廓檢測方法獲得細胞邊界，并對細胞邊界進行橢圓擬合，確定細胞的中心和長短軸；

S2，利用有限元模型對電極接近貼壁細胞上表面的過程進行電學仿真，確定電極到細胞表面距離與檢測電阻上升數值之間的關系曲線；

S3，在由長半軸與短半軸包裹的四分之一細胞表面上選取五個檢測點，利用電極下降過程中的檢測電阻值變化，進行細胞上表面五個檢測點處細胞高度的無接觸測量，由高度檢測結果通過曲面擬合獲得整個細胞的三維形態。

進一步地，步驟S3中，細胞表面選取的五個檢測點中，一個為細胞橢圓中心點，兩個為靠近電極一側的橢圓長半軸起點和中心，兩個為橢圓短半軸起點和中心。

進一步地，步驟S3中，五個檢測點處的細胞表面高度無接觸測量中，電極電阻值上升0.2％時，電極距離細胞表面的距離為1μm，各個檢測點處的細胞高度值由電極的初始位置減去電極下降的距離，再減去1μm計算得到。