[發明專利]一種藻紅蛋白(PE)與Annexin V蛋白偶聯方法

在審

• 申請號: 202011149769.1
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112745378A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 郭愛龍
• 申請（專利權）人: 杭州聯科生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/10;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/70
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 周瓊

1.一種藻紅蛋白(PE)與Annexin V蛋白偶聯方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：Annexin V蛋白表達純化：

1.1：基因序列優化：查找人Annexin V蛋白的基因序列，將人Annexin V基因序列優化，去除終止密碼子序列，將其連入原核表達載體pET28a上，保留前后His標簽蛋白，為蛋白純化及后續偶聯熒光素純化做準備；

1.2：Annexin V蛋白誘導表達：挑取pET28a-Annexin V質粒單菌落，接種到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基中，37℃200rpm振蕩培養過夜，按照1：100將培養的菌液接種到含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基中，37℃200rpm振蕩培養至菌液濃度OD₆₀₀為04-0.6，取出1ml菌液作為未誘導，剩余菌液加入IPTG至終濃度0.5mM，置于恒溫搖床中，于28℃、150rpm/min誘導6h；

1.3：Annexin V蛋白菌液破碎：將收集的菌液離心，PBS清洗兩遍，加入超聲裂解液20mMNaH2PO4，300mM NaCl，pH7.4重懸菌體，加入終濃度500μg/ml溶菌酶和1mM PMSF，混勻后，冰上孵育15min，冰上超聲破碎儀破碎處理，超聲結束后，4℃，12000rpm離心20min，收集上清溶液進行純化；

1.4：Annexin V蛋白純化：采用Ni-NTA瓊脂糖層析柱純化表達的Annexin V蛋白，用平衡緩沖液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4平衡層析柱，將Annexin V總蛋白上柱，用平衡緩沖液洗去未結合蛋白，加入洗脫緩沖液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4進行洗脫，分管收集，SDS-PAGE鑒定每管蛋白純度，合并純度大于90％蛋白，用PBS緩沖液，10kD的透析袋進行透析過夜，收集透析后Annexin V蛋白，BCA法對蛋白定量；

步驟2：藻紅蛋白(PE)巰基化：取5mg PE溶液于1.5ml離心管中，12000rpm離心10min，棄上清，加入0.1MPB重懸沉淀，pH7.2，利用脫鹽柱對PE脫鹽處理，脫鹽后調整濃度為10mg/ml，3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)溶解于DMSO中配制30mg/ml母液，按照PE與SPDP摩爾比1:30加入SPDP母液，輕輕混勻，用鋁箔紙封好反應混合物，室溫振蕩孵育2小時，反應結束后用脫鹽柱脫鹽除去未結合的SPDP小分子，脫鹽后的PE-SPDP溶液中加入DTT至終濃度50mM，輕輕混勻后，室溫靜止反應30min，反應結束后用脫鹽柱脫鹽除去游離DTT；表達載體

步驟3：Annexin V蛋白衍生化：取1mg Annexin V蛋白溶液5mg/ml于1.5ml離心管中，將琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于DMSO中配制30mg/ml母液，按照Annexin V與SMCC摩爾比1:30加入SMCC母液，輕輕混勻，室溫振蕩孵育2小時，反應結束后用脫鹽柱脫鹽除去未結合的SMCC小分子；

步驟4：PE-SPDP與Annexin V-SMCC共價偶聯：按照PE-SPDP與Annexin V-SMCC摩爾比1:1混合后，室溫振蕩孵育2h，孵育結束后每mg蛋白加入5μl N-乙基馬來酰胺(NEM)，室溫振蕩孵育30min，終止反應；

步驟5：偶聯產物純化：先采用AKTA蛋白純化儀進行純化，純化柱型號HiLoad 16/600Superdex 200pg，流動相1×PBS，pH7.4，檢測波長280nm，洗脫順序依次為Annexin V-PE、游離的PE、游離的Annexin V，由于藻紅蛋白(PE)易于軸向擴散，導致分離純化的Annexin V-PE中有少量的游離的PE，所以將收集洗脫的Annexin V-PE進一步采用Ni-NTA瓊脂糖層析柱純化濃縮上述收集的Annexin V-PE，用平衡緩沖液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4平衡層析柱，將上述收集的Annexin V-PE總蛋白上柱，用平衡緩沖液洗去未結合蛋白，加入洗脫緩沖液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4進行洗脫，分管收集，流式染色鑒定每管收集蛋白是否具有凋亡檢測活性，合并具有凋亡檢測活性蛋白，用1×PBS緩沖液，50kD的透析袋進行透析過夜，收集透析后偶聯產物Annexin V-PE；

步驟6：偶聯產物檢測細胞凋亡：

6.1：集0.5-1×10⁶個HL60細胞，離心洗滌兩次，棄上清；

6.2：用500μl陽性質控液重懸細胞，置冰上孵育30分鐘；

6.3：用預冷PBS離心洗滌，棄上清；

6.4：加入適量預冷1×Binding Buffer重懸，并加入數量相同且未經處理的活細胞與之混勻，加入預冷1×Binding Buffer補充至1.5ml，等分三管，其中一管為空白對照管、兩管為單染管；

6.5：單染管分別加入5μl Annexin V-PE，室溫避光孵育10分鐘。