[發明專利]中性脲酶固定化及其在降解黃酒尿素中的應用

在審

• 申請號: 202011149329.6
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112126640A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 王棟;徐巖;李童
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12H1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明提供了中性脲酶固定化及其在降解黃酒尿素中的應用，屬于發酵工程技術領域。本發明以安全無毒的殼聚糖和氧化海藻酸鈉分別作為載體和交聯劑，采用共價結合法對植物來源的中性脲酶進行固定化，使獲得的固定化中性脲酶耐酸性有顯著提高。將此固定化中性脲酶處理黃酒，分批處理可有效減除黃酒中約98％的尿素。該方法使對黃酒中尿素的降解基本沒有作用的中性脲酶，成為可替代酸性脲酶，可作為用于黃酒中尿素降解的酶制劑。且固定化酶便于回收，可重復利用，在黃酒中基本沒有殘留。可以安全有效地降低黃酒尿素的含量，從而控制黃酒中氨基甲酸乙酯的含量，為保障黃酒的安全性提供了新的途徑。

技術領域

本發明中性脲酶固定化及其在降解黃酒尿素中的應用，屬于發酵工程技術領域。

背景技術

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate或Urethane，簡稱EC)，是一種具有遺傳毒性及較強致癌性的物質，天然存在于多種發酵食品(如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒、日本清酒、白蘭地)中。2007年國際癌癥研究機構IARC(the InternationalAgency for Research on Cancer)將EC歸類為2A類致癌物。在酒精飲料中，我國傳統黃酒中的EC含量相對較高，這不僅限制了我國黃酒的出口，同時也引起人們對其長期飲用所存在的安全方面的擔憂。

研究發現，黃酒中的尿素是EC的主要前體物質，90％左右的EC是由尿素和乙醇經化學反應生成的，因此控制黃酒中的尿素含量對于控制EC的生成具有重要意義。關于黃酒中尿素的控制，目前已有一些方法報道，其中利用脲酶是較為直接、簡便的方法。但是由于黃酒的酸性環境(pH 4.0左右)，國內外大部分研究者主要對酸性脲酶研究較多。雖然酸性脲酶對黃酒中尿素的降解有一定的效果，但酸性脲酶目前只有日本和美國的少數企業實現工業化生產，其進口和使用的安全性問題在國內都有一定的限制。而國內對酸性脲酶的研究還停留在實驗研究階段，尚無商業化酸性脲酶供應，這就大大限制了酸性脲酶處理黃酒的工業化應用。目前有實審階段申請專利“食品級脲酶、制備方法及其在黃酒中的應用”(專利號201810670334.8)公開了脲酶在黃酒中的應用，但該專利并未公開食品級脲酶的來源和性質以及在是否真的能夠應用于黃酒中。

我國目前市售的商品脲酶，基本上是植物來源的中性脲酶，其價格便宜，來源廣泛。但該酶在在酸性條件下酶活很低，一般認為這種中性脲酶不適合用于黃酒中尿素的降解。近幾年國內外對脲酶的固定化研究表明，固定化可以提高脲酶的穩定性和利用效率，但關于中性脲酶的研究很少。有報道利用固定化中性脲酶處理黃酒，需將黃酒pH調至4.8以降低其中的尿素含量。但中性脲酶固定化后是否可以在不改變黃酒特性的條件下用于黃酒中尿素的降解，目前鮮有相關研究報道。

綜上，目前尚沒有文獻或專利公開利用安全可靠的固定化中性脲酶直接用于黃酒中降解尿素的方法。

發明內容

技術問題：

降低黃酒中的尿素含量是控制黃酒中危害物EC的有效手段。但是目前通過脲酶酶法降解黃酒尿素存在諸多限制。活性較高的酸性脲酶國內尚處于研發階段，尚未實現商品化生產，而商品酸性脲酶主要由國外公司生產，進口及在食品行業應用都收到限制。植物來源的中性脲酶國內雖有生產，但不適用于黃酒的酸性體系，無法有效降解黃酒中的尿素。如何基于國內現有條件，開發可用于黃酒中尿素降解的脲酶制劑，并進行黃酒尿素的有效控制，目前沒有切實而可行的方法。

技術方案：

為了解決上述問題，本發明提供了一種利用固定化中性脲酶降解黃酒中尿素的方法，本發明使用植物來源的國產中性脲酶，通過安全無毒的固定化材料和方法制備固定化酶，用于黃酒的尿素降解。該方法可有效地降解黃酒中的尿素，尿素降解率最高可達98％。而且該酶制劑及方法安全無毒，可滿足食品行業的要求，為黃酒行業EC的控制提供一條切實可行的途徑。